作者SHARKr1 (毓? ? )
看板Biotech
标题Re: [求救] FPLC纯化蛋白(补新问题)
时间Mon Feb 11 15:00:47 2019
※ 引述《wizchoco》之铭言：
机型：AKTA avant
Column : HIC
1_sample application
手动injection後会设定高盐A相去洗loop
这时会有一些杂讯(导电度下降、高UV吸收)，原以为是solvent peak，但不含solvent的
样品也有此现象，会是空气跑进column吗？还是纯粹样品没binding上去?(但不懂导电度
为何会下降？)，而且收下来测浓度量也不多，有用硷洗机台和column，但此情形没改善Q
Q
你可能是设定到用Buffer B去推送样本了！
机台的设定上原本就会是用buffer A将loop内的样品推送到column。假设你没有再做其他
额外的设定的话。导电度的变动应该不会很大。但是你看到导电度下降再加上高UV吸收，
显然是设定有问题。当然你也可以怀疑是不是有空气。简单的确认方法是看一下你的压力
曲线。是不是压力很不稳定，如果是的话哪很有可能是进空气了。接着你应该检查loop跟
column head的连结是不是确实连结好没漏气。
2_Elution流速会影响纯化效果吗?
目前使用流速0.6mL/min实在流太久了，想问流速增加到1-1.2mL/min是否会使binding在c
olumn上的样品，更容易被洗下来，影响纯化效果？
Elution的流速是会影响没错，但基本
上他可以再一定的范围内调整。由於没有提到你的任何实验细节（resin种类、管柱内径
大小、温度等等），因此很难告诉你有没有影响。一般来说应该用体积流速去评估是否会
有影响。以1ml的 Hitrap Sepharose FF的胶体来说。这种介质的线性流速建议在100-150
cm/hr上下。一般保险起见都抓在50-75cm/hr。0.6ml/min的体积流速大约在70cm/hr。你
往上调到1.2应该是值得一试。若你不想改，最快的方法是改变平衡跟column wash的速度
。因为这两步骤影响最小。
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3_回收率
使用手动针筒loading，针筒前端会残留，injection valve也会有一段残留
Column用低盐B相和水洗，UV值都在baseline上，所以应该没卡在column上
最怀疑的就是injection後A相洗loop的不明杂讯，可是收下来测UV量也没那麽多
想问还有哪些部分会影响回收率？
针筒的残留基本上不用太在意。若真的有影响的话表示你的蛋白质太少，禁不起一点点的
损失。也表示你的实验会很难做....
建议全面跑个胶片，评估一下从lysate到纯化後的回收率才好判断。
4_刚才发生的新问题QQ
样品injection後，高盐洗loop时杂讯跑出来，结果UV降不下去还一直飙高(导电度维持正
常值)，以为样品没binding上收样测浓度也很低，目前是先用高盐把UV洗到baseline，再
继续跑gradient做Elution，结果如何明天才知道，就是不知道为何UV会突然飙高啊啊啊(
崩溃)
其实我建议你整个方法步骤最好从内建的template去改。会比较好debug
麻烦大家了～～～谢谢～～QQ
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1F：→ Ianthegood: 个人没用过hic 不过经验是流速绝对影响 前面那个peak01/24 02:49
2F：→ Ianthegood: 大概是pressure peak 回收量低很有可能是你sample loa01/24 02:49
3F：→ Ianthegood: d太少01/24 02:49
4F：推 july81212: 导电度应该是有残留低盐度的buffer在loop loop本身要201/24 07:59
5F：→ july81212: -3倍体积才能完全填充 不过残留量小不太会影响binding01/24 07:59
6F：→ july81212:01/24 07:59
7F：推 july81212: 另外调流速前要先看你要的peak分辨度如何 一般会先从g01/24 08:02
8F：→ july81212: radient 调完再调整流速部分01/24 08:02
9F：推 july81212: 杂讯我想先不管量的问题 洗出时间在injection後 有小01/24 08:12
10F：→ july81212: 於2CV 也有可能是unbinding protein 建议跑个胶check01/24 08:12
11F：→ july81212: 一下 如果没有你的target 那就不用太担心01/24 08:12
12F：→ wizchoco: 感谢大大们回答～～loop在使用前都有先用大於5CV的水和01/24 12:24
13F：→ wizchoco: 大於5CV的高盐去洗了01/24 12:24
14F：→ wizchoco: 回收率部分，有用低盐和水去洗，都没洗出什麽，但用0.1N01/24 12:26
15F：→ wizchoco: NaOH去洗，就有高UV吸收被洗出来01/24 12:26
16F：→ wizchoco: 看来是卡在column上QQ01/24 12:27
17F：→ Ianthegood: 只能用hic? 要不试试iex?01/24 22:16
18F：→ wizchoco: 目前没办法换IEX QQ01/24 23:26
※ 编辑: wizchoco (123.195.190.114), 01/24/2019 23:42:03
※ 编辑: wizchoco (123.195.190.114), 01/24/2019 23:46:29
19F：推 rasaze: 高盐有时会造成小盐块析出卡在detection cell用大量水溶01/26 13:25
20F：→ rasaze: 解洗掉就好，之前做高盐样本有遇过，给您参考 01/26 13:25
21F：推 rickson: 恩 02/02 19:02
22F：推 windcloud27: 我这边的业务是教说每次跑完高盐的buffer後都要用热 02/08 23:22
→ windcloud27: 水冲一遍机器 用热水冲机
器一点用都没有。用纯水去洗机会还大一些02/08 23:22
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※ 编辑: SHARKr1 (42.74.157.52), 02/11/2019 15:04:13
23F：推 Ianthegood: 推专业 02/11 22:26
24F：推 mars8586: 推 03/09 23:51