作者steve42125 (Shiburin)
看板Biotech
标题[求救] Matrigel seeding细胞後隔天看到网状结构?
时间Sat Dec 22 14:18:37 2018
先谢谢大家上次关於Transwell migration fix给予的建议，
终於成功了。
於是接下来用Transwell coating matrigel进行invasion实验，
重复了两次都以失败告吹，
发现用棉花去除上层染色後，
整个Well竟然跟全新的一样XD
这次在染色前先拿到显微镜下看看到底有没有细胞爬过去，
不看还好，一看惊为天人，
竟然长蜘蛛网了!?
https://imgur.com/d01nT5x
(此为Seeding细胞24hr後的image)
然後稍微前後调一下焦距看起来细胞是完全没有爬过去的，
不知道是不是因为这个蜘蛛网的关系。
因为自己是完全照着protocol在操作，
完全想不出到底哪里发生了问题，
下面附上自己操作的详细流程，
跪求大家帮忙隔空抓药，感谢再感谢！
1.先将Transwell, tip, 24 well plate放进-20冰箱预冷,O/N
2.将Matrigel从-20冰箱移到冰上解冻至完全液化(大约40min)
3.将matrigel以冰的serum free medium以1:3.5的比例稀释後，on ice 30 min
4.在chamber中加入50ul稀释後的matrigel, 放4度冰箱15分钟确保其完全摊平
5.移至incubator O/N使其完全固化（通常两三个小时後和隔天都会去看一下，
都还铺得满平满正常的，看起来很均质，没有任何异状。）
6.隔天在chamber内seeding 5*10^4 in 200ul serum free medium 的细胞液
7.下层加入800ul 10%FBS complete medium,
8.Incubate 24~26小时之後以100% methanol fix後染色。
以上为我详细的操作流程，如果有需要我补充的地方欢迎大家告知，
也恳请大家帮忙隔空抓药或分享自己的经验，
看到这着蜘蛛网真是又哭又笑又不知道如何是好XDD
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※ 编辑: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 14:19:25
※ 编辑: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 14:19:43
※ 编辑: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 14:20:58
1F：推 soend: 这是tube formation了？是不是matrigel coating太多了？ 12/22 15:55
Tube formation是? 50ul我觉得应该还是算少的，查了不少paper好像大家都是用100ul
是怕太厚想说减半，这样的体积厚度大概是1.5mm
※ 编辑: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 16:02:30
稍微查了一下就结果的image还真像XD，在想会不会是用的matrigel太硬了?
※ 编辑: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 16:11:01
2F：推 soend: Tube formation是seeding HUVEC到matrigel上看angiogenesis 12/22 16:11
3F：→ soend: 的能力，就是长得跟您的图一样，是网状结构，这样可能代 12/22 16:11
4F：→ soend: 表您的细胞invasion 能力不强？无法穿过matrigel？ 12/22 16:11
先谢谢您的补充，不过我所养的cell line是比较偏上皮型态的cancer cell(H1299)
在查paper的时候大家都是coating 100ul的体积（但是都没写是稀释几倍）
原本担心会爬不过去所以将厚度减半，现在可能要考虑的是将稀释倍数拉高?
※ 编辑: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 16:15:49
5F：推 soend: 我有查到一些protocol稀释比例可能要依细胞调整，从1/3～1/ 12/22 16:23
6F：→ soend: 8都有，所以可能要试看看才知道了 12/22 16:23
好的～谢谢您拨冗和我讨论跟分享你的看法 谢谢!
※ 编辑: steve42125 (36.224.17.189), 12/22/2018 19:58:43
7F：推 untilnow: 上皮细胞类的蛮多都会tube formation 12/22 21:41
8F：推 Devilxxx: 哇成tube了XDDD 02/28 20:33
9F：推 sianpa00: 想请问一下原po是如何把matrigel铺平，我也是用50ul,但 03/09 17:02
10F：→ sianpa00: 不管怎麽用都会有因为表面张力的凹陷，做出来细胞也聚 03/09 17:02
11F：→ sianpa00: 集在中间，我铺完也放4度，还试过先加100ul在吸出来QAQ 03/09 17:02
12F：推 sianpa00: 另外想请问一下稀释完on ice 30分 有什麽特别的用意吗？ 03/09 17:06