作者TsushimaRiko (津岛梨子 善子の小守护进)
看板Biotech
标题[求救] 湿式transfer 低分子量东西很少?
时间Thu Nov 22 02:10:04 2018
因为我要看的份子量从110kDa的apaf1到到17的LC3都有
所以我试着用12%SDS-PAGE去transfer:
平常会先各跑一片胶後染coomassie blue去看sample中蛋白浓度去做微调
再跑transfer
power是用bio-Rad
用的是hybond的NC膜
transfer条件老师是教300mA，90min
奇怪的是两个月前测条件时觉得这个条件还可以
但过一阵子发现caspase3的部分(即分子量32以下)染抗体几乎染不到 不然就是染不均
匀
想当然LC3也是染不到的
回去看一开始跑的SDS PAGE
32kDa以下的蛋白确实比上半部分少但不至於全白
有时候拍冷光 时间间隔设15秒，灵敏度调super 依旧得拍到快900秒才有东西
一直想换条件但不太敢跟老师学姐讲
该怎麽换条件自己也没有头绪
主要想问各位想看caspase3时都习惯用什麽条件去transfer
我这样tran有没有什麽问题?
有需要的话我明天到实验室会附上拍好的冷光照片 或是有缺什麽需要放上来的
*突然想到虽然固定300mA，但我还是会观察transfer期间电压的变化
正常情况下电压会从160V左右慢慢降到150左右 最後稳定在145上下
这时候tran出来的actin是最漂亮的
有时候tran的期间电压不对会染不出东西
老师推测可能是学校插座的电流电压问题什麽的老师也没办法有一个合理的解释
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1F：推 tynse71864: transfer bfr有 MeOH 吗11/22 09:59
tris-base 3.03g+glycine14.4g加水到800ml
+
200ml甲醇
※ 编辑: TsushimaRiko (223.141.192.10), 11/22/2018 12:21:56
2F：推 as862437: transfer buffer 用的次数？11/22 13:24
3F：推 as862437: 做过10kDa的小分子(6E10)，印象是低电压 4度on确定Trans11/22 13:28
4F：→ as862437: fer buffet fresh ,效果较佳11/22 13:28
我们都是当天用早上现配的 然後冰4度c备用
那想问一下你transfer的时间是多久呢？
※ 编辑: TsushimaRiko (223.141.192.10), 11/22/2018 15:20:51
5F：→ Ianthegood: 我的蛋白10/14kDa 用一般的protocol都转得过去耶 有11/22 17:15
6F：→ Ianthegood: 用ponceau s染membrane吗? 转完的胶也可以染coomassie11/22 17:15
7F：→ Ianthegood: 看看剩多少11/22 17:15
8F：推 as862437: 印象中是overnight11/22 17:40
9F：→ xxtomnyxx: 电压会变和插座供电没关系，如果插座供电不稳就会让电11/22 17:46
10F：→ xxtomnyxx: 压改变，那这电源供应器可以砸掉了。V=IR 当你固定 I，11/22 17:46
11F：→ xxtomnyxx: V 就会随着 R 变动，以溶液(transfer buffer)做为导体11/22 17:47
12F：→ xxtomnyxx: 时电阻受温度影响会相当明显，或是溶液不均质时也会造11/22 17:48
13F：→ xxtomnyxx: 成电组变动。在 transfer 时因为对溶液通电，温度会慢11/22 17:48
14F：→ xxtomnyxx: 慢上升，电阻因此下降，定电流下电压自然就会跟着下降11/22 17:49
所以可以说 一开始电压上不去就是transferbuffer的问题喽?
15F：→ xxtomnyxx: ，这其实可以做为 transfer buffer reuse 的标准，当11/22 17:50
16F：→ xxtomnyxx: buffer 因 reuse 次数太多而降的太低使电压升不上去时11/22 17:51
17F：→ xxtomnyxx: 就是该换新的 transfer buffer 的时候了。11/22 17:51
18F：→ xxtomnyxx: 你的问题，我会试试看在 transfer buffer 中加 0.03~11/22 17:55
19F：→ xxtomnyxx: 0.1% 的 SDS。我实验室的 transfer buffer 固定会加11/22 17:56
加SDS会不会让小分子太过去啊
20F：→ xxtomnyxx: 0.0375% 的 SDS。11/22 17:56
https://i.imgur.com/HTuJv85.jpg
transfer之後的胶
https://i.imgur.com/t5IH7jE.jpg
染caspase3後冷光 上下分别为两个组别
https://i.imgur.com/Jxhktl8.jpg
与actin比较
21F：→ Ianthegood: ker 不过如果你在membrane上看得到target band而weste11/22 19:13
22F：→ Ianthegood: rn没有那就肯定是抗体挂了11/22 19:13
其实我每次tran完後membrane红染，低分子量真的比上半部少 我在想是不是sample本身就这样?
我的sample 是hole cell去lysis
※ 编辑: TsushimaRiko (223.141.192.10), 11/22/2018 19:20:41
23F：→ Ianthegood: 跟你的coomassie全染比较? 11/22 22:10
24F：推 osla30: 改用PVDF膜 11/23 00:17
25F：推 eric127: LC3就用PVDF吧～低於25kD的NC会上不去。100V, 60mins 11/26 04:50
26F：推 joseph103331: 我们都是用NC看LC3. 用pore size决定你的时间 11/26 15:53
27F：→ joseph103331: 0.45的话, 20kDa以下的蛋白质不要超过94V,60min 11/26 15:54
28F：→ Ianthegood: 抗体？新的stock? 11/26 16:58
29F：→ TsushimaRiko: 抗体已经确定是新配好的 然後coomassie blue 11/26 21:29
31F：→ Ianthegood: 看起来transfer没问题啊 11/27 00:22
32F：推 tynse71864: CMB那个是染胶吧？ 11/27 12:33
33F：推 MADAOTW: NC膜孔洞大，小分子会穿过 12/02 18:47
34F：→ MADAOTW: 一些 youtube 的教学影片有提过 12/02 18:48
35F：推 hank99911: 用pvdf 湿式25v 2.5 hr 转25KDa没问题 每次都会成功， 12/06 12:35
36F：→ hank99911: 而且western灵敏度很高，我his纯化之後的蛋白，膜上几 12/06 12:35
37F：→ hank99911: 乎看不到，但western讯号就很强 12/06 12:35
38F：推 hank99911: Transfer buffer条件跟你一样，只是我的有SDS，使用的 12/06 12:36
39F：→ hank99911: 是invitrogen 的Xcell转殖槽 12/06 12:36
40F：推 danielwu0728: 膜的孔径确定一下啊 pvdf有0.45跟0.22两种 .45抓不 02/06 16:02
41F：→ danielwu0728: 到30以下的 02/06 16:02
42F：→ danielwu0728: 我不知道你那种膜会不会也有分 02/06 16:02
43F：推 Devilxxx: 小分子的要用.22的膜而且建议缩短转的时间至半小时一小 02/28 20:37
44F：→ Devilxxx: 时 02/28 20:37
45F：推 bob79620: 小分子量的蛋白要用0.22的膜,并且transfer安培数及时间 03/01 16:37
46F：→ bob79620: 是关键,我之前也跑过cleaved Caspase-3 建议用 0.15 mA 03/01 16:39
47F：→ bob79620: 12-16小时 03/01 16:40
48F：推 skykoc: 不谈你细胞本身好不好压，或抗体买到不好的，LC3/Claved 06/13 21:34
49F：→ skykoc: cascade-3(我习惯Pro跟cleaved都跑，但以cleaved为主）用 06/13 21:34
50F：→ skykoc: 15%SDS-PAGE跑，transfer membrane我用过PVDF/NC，孔径用 06/13 21:34
51F：→ skykoc: 过.45/.2都有，没问题的，transfer的部分100V/50min/350m 06/13 21:34
52F：→ skykoc: A (注意V，掉到100以下时，请提高mA）尤其LC3，非常好跑 06/13 21:34
53F：→ skykoc: 。 06/13 21:34