作者steve42125 (Shiburin)
看板Biotech
标题[求救] 细胞打散後放一阵子後严重成团无法解决
时间Mon Nov 19 17:44:48 2018
大家好
不好意思又来求救了
最近在做细胞实验时
细胞严重抱团的情形一直大大的困扰我
已经崩溃到欲哭无泪的地步
细胞是NSCLC的H1299
实验步骤是这样的
以0.5ml trypsin-EDTA消化大约3min之後以1.5ml medium中和
离心1250rpm, 5mins後去除上清以适当比例打散
打散的方法是会先用200ul pipette打大概30次
再以1ml pipette取1ml medium再打大约20次之後依pellet大小稀释进行细胞记数
因为一次手上有3个clone会同时处理
会全部打散完之後
各取10ul进行细胞记数
所以从取完到全部数完和计算之後大概会花10分钟
情况大概是这样
在Counting chamber底下看没有任何异状，细胞颗颗分明
但是种到6cm或10cm dish之後会发现细胞严重抱团，几乎是一串串葡萄装在盘子里的感觉
有试过拿Autopipette把盘中的液体全部吸起再pipetting几次(但是很抖很怕喷出来)
去显微镜下以8字摇大约15趟左右摇匀後看有散开，
想说静置个5~10分钟左右再移到incubator
但大概5分钟多之後再回去看细胞又全部抱成一坨
想问问大家有没有什麽意见或想法
或是觉得我可以改进的地方
希望能在离心收完细胞的时候就能把细胞完全打散
然後希望尽量能不用到autopipette，因为觉得塑胶tip有点浪费.....
(虽然我开始觉得好像无可避免了.....)
毕竟种到dish才发现抱团，也不知道是不是一开始就没打散
会让後续的细胞记数很不准，实验根本没办法进行......
希望大家救救我，被这个问题已经困扰到头痛胃痛了QQ
先谢谢大家！
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 120.126.49.182
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1542620691.A.E4A.html
1F：推 tynse71864: trypsin打久一点 11/19 21:07
可是已经Trypsin到细胞都有变圆圆的，轻拍也都有一部份的细胞飘下来了
用medium冲也可以容易洗下来，这样还要再增加时间吗?
怕细胞会受损QQ
2F：推 iyorain: 摇的手法改一下，米字，每个方向摇过去後要停住，不要产 11/19 21:30
3F：→ iyorain: 生漩涡，请不会成团的人带你摇看看吧~ 11/19 21:30
因为我在显微镜下刚摇完的等液面静止後看都是一颗一颗的
是静置之後才会成团，而且团块也是均匀分布，这样还会跟摇的手法有关吗?
※ 编辑: steve42125 (36.224.9.103), 11/19/2018 21:51:44
4F：推 iyorain: 拿下来时候也注意一下漩涡 尽量稳 11/19 22:50
好 我会试试...
※ 编辑: steve42125 (36.224.9.103), 11/19/2018 23:30:06
5F：推 tynse71864: 打散30次我觉得细胞也差不多挂了…… 11/19 23:38
6F：推 chijoan: 我都是8000rpm/3min，也不会成团捏，之前有几次遇到，问 11/20 22:59
7F：→ chijoan: 学姐是建议细胞不要养到非常满，打下来後会像葡萄一样难 11/20 22:59
8F：→ chijoan: 打散，给你参考 11/20 22:59
谢谢你宝贵的意见！ 我会注意的!
※ 编辑: steve42125 (36.224.17.22), 11/21/2018 08:37:41
9F：→ Ice9: 离心机条件请尽量用 rcf 表示，毕竟每家离心机大小都不一样 11/25 18:09
10F：→ lesswind: 8000rpm细胞不会死吗?转速也太高了吧 12/05 16:06