作者ararthur (RAYPTT)
看板Biotech
标题[求救] 透析後的纯化蛋白BCA定量问题
时间Thu Jul 19 12:39:03 2018
有关蛋白纯化/透析/蛋白定量的问题想请教，
我自行纯化的纯化蛋白X 在透析前以BCA定量，
测定出来的浓度在 56.5 ug/ml；
以Thermo SnackSkin透析膜(10k MWCO) Dialysis後再以BCA定量，
测定出来的浓度却高达 1100 ug/ml，
请教有什麽可能能够解释出现这种状况吗？
非常感谢！
PS1 原Sample buf condition = 25mM Tris-HCL, 100mM Glycine pH未知
PS2 蛋白纯化过程的buf如下
Elution buf= 1ml of 100mM Glycine (pH 3.5)
Nutralization buf= 25ul of 1M Tris (pH 8.0)
PS3 Dialysis buf condition = 25mM Tris-HCL, 100mM Glycine (pH 7.3)
PS4 由於buf condition是相同的，透析前後体积未剧烈变化
PS5 透析前後BCA呈色状况不同(前:淡蓝绿色 vs. 後:类似stanard的紫色)，
如图所示
https://imgur.com/YVeFpiy
PS6 两次BCA的 R^2 均>0.996
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1F：推 joseph103331: 看起来很像透析前的buffer影响的喔 07/19 17:23
2F：推 duriamon: 有可能影响BCA定量的干扰物被你用透析去掉了。也可以确 07/19 17:35
3F：→ duriamon: 认一下BCA定量的compatible table看看使用的buffer会不 07/19 17:35
4F：→ duriamon: 会影响。 07/19 17:35
谢谢，另外我有测Sample与Dialysis buf的pH值，都是相近的中性(用试纸测试)，
重做一次BCA，也是一样的结果，
我来找看看BCA定量的资料，是否Buffer或其他干扰物有可能造成此现象。
5F：推 chenmick: 你透析几次？每次体积多少？ 07/19 19:03
您好，透析两次各两小时，Sample体积2.5ml，Buffer体积500ml。
6F：→ NSB35573: 蛋白质样品用透析方法很容易染菌 07/19 21:47
7F：→ NSB35573: 另外protein assay 会被四级胺影响,例如0.1M的Glycine或 07/19 22:47
8F：→ NSB35573: CTAB等等。 07/19 22:47
您好，透析过程我都将烧杯至於冰中，理论上应该是不会菌的污染才是
谢谢，但我是推估前後sample的buf是一样的，所以还在想到底哪一项没估算到@@
9F：推 chenmick: 会不会纯化前有还原剂，SDS或金属螯合剂？ 07/19 23:28
谢谢回覆，有猜测，但理论上在纯化过程时应该已经被冲洗掉了，
我会试着用不同的蛋白定量方试看看，
会先试看看Bradford assay，再上来跟大家报告，谢谢大家的回覆。
※ 编辑: ararthur (140.112.121.122), 07/20/2018 10:44:58
今天用Bradford assay 测定Dialysis前後的蛋白浓度，
令人讶异所测到的浓度相仿，看来BCA assay并不适合我的重组蛋白...
另外以Coomassie Blue R250染出来的band 透析前後也是差不多，
Coomassie Blue system (包含Bradford)似乎比较合适。
谢谢各位参与讨论 <(_ _)>
※ 编辑: ararthur (140.112.121.122), 07/20/2018 14:39:46
补充一下，後来我使用BCA protein assay 将reagent B提高3x (Cu2+浓度提高)
便可以让dialyzed protein呈现与undialyzed protein相仿的浓度了!
看来是dialysis影响了Cu2+的还原了...但原因仍未解
提供一些经验供大家参考 再次谢谢
※ 编辑: ararthur (36.229.11.1), 08/13/2018 00:52:43