作者ararthur (RAYPTT)
看板Biotech
标题[求救] 请教IP-Mass後的Co-IP验证
时间Fri Jul 6 11:29:06 2018
大家好 这里有一些与Co-IP、protein-protein interaction的问题想请教
我们以IP-Mass Screen出一些欲研究蛋白"X" 之interacting protein candidates後
(Y1.Y2.Y3...)
再使用Co-IP重复验证X与Y们的interaction
发现如果IP下X的immunoprecipitates 能够以Western blot侦测到 X Y1 Y2 Y3等的存在
但是反过来分别IP Y1 Y2 或Y3时 却都只能侦测到他们自身的存在 而无法侦测到X
(使用IP用Ab或另一只anti-X Ab都无法侦测到)
请问这样的情况应该如何解释？ 或是说单向IP的证据就已足够？
第一个想法是量的差异
如果X可以结合10个蛋白其中一个是Y1 而Y1可以结合1000个蛋白其中一个是X
那自然抓下X容易侦测到Y1 可是反之却不然
第二个想法是Ab-Ag在IP过程中conformation改变
进而影响结合蛋白情况 但这相当难以实验证实
最後 我也有猜测X的Ab专一性太低 抓到许多非X的杂蛋白 所以才侦测到false positive
但若是这种情况 IP下 Y1 Y2 Y3 仍然应该可以用anti-X去侦测到才对(?)
PS1 我们IP的target都是endogeneous protein，细胞均未处理/未overexpress
PS2 IP-Mass的结果是重覆两次相同实验後取交集而来
PS3 IP过程均有做Posi/Negative control (Whole lysate, beads only, IgG isotype)
PS4 IP与WB都是用同一只抗体
有任何资讯不足的再请提出 非常谢谢大家
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.112.121.122
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※ 编辑: ararthur (140.112.121.122), 07/06/2018 11:56:00
1F：推 tynse71864: IP a抓到 b ,不代表反过来做就会成功，必须考虑IP用抗 07/06 11:47
2F：→ tynse71864: 体的epitope; 尤其你又是 endogenous protein 07/06 11:47
3F：→ tynse71864: 可能你b抗体认的位置就是 他跟 a interact的位置,那你 07/06 11:48
4F：→ tynse71864: 怎麽抓也都只有 freeform的 b而已 07/06 11:48
5F：推 tynse71864: 可能染个 IF或 用293t o/e 接 tag的蛋白去证明吧，真 07/06 11:56
6F：→ tynse71864: 的要的话 07/06 11:56
谢谢 请问染IF是看 co-localization吗?
※ 编辑: ararthur (140.112.121.122), 07/06/2018 11:59:34
7F：推 tynse71864: 嗯嗯没错，我那时是做到单向 IP跟染色; 想做更细一点 07/06 12:14
8F：→ tynse71864: 也能做 GST pulldown assay，但这也未必会成功就是了 07/06 12:14
9F：→ tynse71864: 。 07/06 12:14
10F：推 july81212: 还有可能是Y1,Y2是beads或resin contaminants 并不是 07/06 16:22
11F：→ july81212: 真的interaction... 07/06 16:22
12F：推 july81212: sorry 没看到你的PS3 不过正常Co-IP 验证会OE 所以第 07/06 16:28
13F：→ july81212: 一点不太会发生 07/06 16:28
14F：推 july81212: 另外T大讲的事件容易发生在小的蛋白上 除了改pulldown 07/06 16:35
15F：→ july81212: 尝试外 也可试试纯化（小tag或不带tag)crosslink 後跑 07/06 16:35
16F：→ july81212: PAGE 或跑SEC看有没有peak shift (之前做～15Da IP或 07/06 16:35
17F：→ july81212: pulldown 常发生 blocking 的现象） 07/06 16:35
谢谢J大回覆
可是我的X蛋白~80KDa Y蛋白们则在40-90kDa
其中X蛋白用的IP 抗体是polyclonal Y蛋白大部分是monoclonal(Brand=CST)
说到Size exclusion chromatography 我之前试图做过lysate直接跑SEC (Akta)
fractions拿去测X蛋白的位置 发现X大约出现在相对MWCO>=440KDa的时间点
所以才非常想知道那麽大的complex里面藏了什麽
18F：推 tynse71864: J大： 没错我两个蛋白刚好15跟25kDa,做起来超崩溃qq 07/06 16:41
19F：→ tynse71864: 还会卡 light chain 07/06 16:41
20F：→ blence: 我觉得会拿来做IP-mass,就至少对抓的效率(%,对比input)有 07/06 19:11
21F：→ blence: 信心,只是Y1,Y2抓的效率差,就只剩IP自己,看不到coIP蛋白了 07/06 19:12
22F：→ blence: 而且我自己经验WB最强跟IP最佳常不相同,如果一定试到底, 07/06 19:13
23F：→ blence: Y系统抗体有需要找IP能抓更多的来试 07/06 19:13
报告B大 其实我觉得我们的实验中
对於input lysate amount来说 X蛋白的IP抓下来的比例并不是很高耶...(惭愧)
送去做Mass 纯粹是我们真的太想知道X的interacting protein有哪些的粗暴方式
不过做了两次IP-Mass 重复出现的比例还蛮高的(有扣除Negative ctrl的 noise)
虽然我知道WB会放大讯号 得到的讯号也只是相对值
但是IP 几个Y蛋白後 WB侦测到他们自己的量还蛮高的 甚至有一个还烧band(过量)了
(~100ug lysate as input) 抓到的效率% 要等我到Lab时看看
我会再考虑其他可用的抗体 或是测看看其他interacting protein candidates
另外有个延伸IP-Mass的问题想询问
IP-mass抓下来的蛋白 我们挖了两条相对於negative ctrl多出来的band去打mass
扣除掉相对位置的IgG isotype control的结果後 还出现数百个蛋白 是常见的事吗？
因为实不相瞒 即使从两次independent IP-mass抓下来交集的蛋白种类都超过150种了...
有点觉得太多XDDD
24F：推 Ianthegood: yeast 2 hybrid? 07/06 23:21
25F：推 Ianthegood: 验证也是MS吗? 07/06 23:24
I大您好 之前也有考虑过Y2H
不过曾听过作Y2H的实验室透露Y2H和IP-Mass screen interacting protein时
常会出现蛮不一致的结果 但Y2H的确和IP的机制不太一样
结果就没有尝试了 就您的经验 用Y2H去验证protein interaction有效率吗？
谢谢各位的回覆^^
※ 编辑: ararthur (36.230.227.43), 07/07/2018 01:12:48
26F：推 tynse71864: y2h 几乎是要重新建立一个新系统欸 07/07 23:08
27F：→ tynse71864: 看你究竟对 Y123是怎样的研究兴趣耶;如果是抓可能的 i 07/07 23:16
28F：→ tynse71864: ntx protein来研究 X的功能, 补个 tag o/e IP 的实验 07/07 23:16
29F：→ tynse71864: 比较快也较接近实际状况 (可还能看 Y123是否跟 X形成 07/07 23:16
30F：→ tynse71864: complex) 07/07 23:16
31F：推 july81212: 1D PAGE一条band打到上百还算正常 07/08 14:52
32F：→ july81212: 另外IP用 polyclonal 很容易抓到False positive 建议 07/08 14:52
33F：→ july81212: 在ID时拉高criteria 话说你如果要问complex 为何不直 07/08 14:52
34F：→ july81212: 接 purify complex直接打MS 配合IP这样不是比较直观吗 07/08 14:52
35F：→ july81212: XD 07/08 14:52
36F：推 july81212: 可以直接crosslink->purify complex(SEC/IP)接MS 07/08 14:54
37F：推 joseph103331: 我觉得做pulldow跟带tag的co-IP比较好 07/08 15:06
38F：→ joseph103331: endogenous association可以交给IF来判定 07/08 15:07
39F：→ joseph103331: 如果觉得IF不够好,也可以试试看FRET 07/08 15:07
40F：→ joseph103331: 不过我们是习惯把结合位去除再来看位置判断居多 07/08 15:08
41F：推 joseph103331: 带tag的实验也可以验证抗体会不会block你的讯号 07/08 15:10
42F：→ Ianthegood: 忽然想到 也许y3是secondary binding 假设是y1 y2的co 07/09 16:06
43F：→ Ianthegood: mplex才抓得到y3? 07/09 16:06
44F：→ Ianthegood: 我是觉得你control有做好 单向就可以发了啦 甚至可以 07/09 16:07
45F：→ Ianthegood: 把反向抓不到也写进results 07/09 16:07