作者shauosan ()
看板Biotech
标题[求救] site-directed mutagenesis
时间Sat Apr 28 15:57:10 2018
最近在做A基因靠近3端不足100bp的点突变,
primer设计如下:
F -----m----------->
5' ------------------------------------------------------3'
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
<------------m----- R
Forword primer长度30bp
Reverse primer长度32bp，m为突变位置，两条primer中间overlap 10bp，
Tm值都大约60、61左右，
目标为6.6kb左右的plasmid，但我一直都P不出来。
PCR材料照phusion产品说明的:
ddH2O add to 20ul
5X Phusion HF buffer 4ul
10mM dNTPs 0.4ul
Forward primer 1ul
Reverse primer 1ul (primer final concentraction 0.5uM)
template 1ul
3% DMSO 0.6ul
phusion 0.2ul
__________________________________________
total volumn 20ul
PCR condition:
98℃ 30s __
98℃ 10s |
55℃ 30s | 25cycle
72℃ 3min20s _|
72℃ 5min
25℃ ∞
template有试过放不同量0.1ng、1ng、5ng、10ng，有加DMSO or 没加，
但PCR一直都跑不出来，
後来有试着用DpnI digest後再拿去transform看看，有长colony，但都萃不到质体。
之前在文献有看到有人说靠近3端的点突变不能直接做，
那篇是用两条延伸到plasmid的primer做，接着进行融合PCR，最後在clone回质体，
不知道这会不会是p不出来的原因?
(可是plasmid不是圆的吗?问了实验室有在做的人都觉得这说法不太合理)
因为之前没经验，问了实验室的人才知道他们都是用complement priemr做，
目前想到的就是重订primer，
不知道版友对於这个情况有没有什麽建议?
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1F：→ blence: 用quikchange的方法,完全没有什麽靠近3端不能做的问题 04/28 16:34
2F：推 joseph103331: 为什麽primer这麽长, overlap这麽少? 04/28 18:34
3F：推 osla30: 用primer back to back方式，不overlap，几乎百分百成功率 04/29 02:07
4F：推 uouim: Transform 到什麽 E. coli strain？ 05/12 14:03
5F：推 Nicoleching: 这时候我会改用Gibson去做... 05/18 08:19