作者fishg1216 (叶绿体)
看板Biotech
标题[求救] genomic DNA digest後的条带
时间Tue Mar 27 11:02:33 2018
大家好!我又来请教问题了。
最近一直在做southern blot,每次做完digestion跑胶後看到的胶图看到smearing 条带是
正常的，但做了几次发现每次digestion几乎每个sample在特定几个位置上都有明显的条
带出现，如下图
https://i.imgur.com/L0AfHvk.jpg
想问这些明显的条带是什麽?谢谢!
注:
1. EcoRI, BamHI, XbaI都有
2. 15 ug DNA做digestion
3. 材料来源是番茄
4. marker为100bp marker
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另一个问题是如何标定marker，先前学长用的是genemark很旧的kb marker，
不知道什麽原因可以让probe hy上去并且在底片显示出来，但後来新出的marker无法。
昨天boss要求marker也要跑出来方便看条带大小。
想问有人了解如何设计a-32p标定的probe定位marker，方法是否方便告知，谢谢!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 39.8.32.60
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1F：→ blence: restriction endonuclease跟一般endonuclease的差别 03/27 11:15
谢谢B大，这个我了解。但是经过切割後在特定位置出现数个明显的大片段条带，
让人很好奇那个区域究竟是什麽?
刚才查到
https://goo.gl/GkVNg6
内文说:"In contrast, genomic DNA from bacterial genomes is millions of base pairs
long, while genomic DNA from eukaryotic chromosomes may be tens of millions
to hundreds of millions of base pairs. Consequently, digests of genomic DNA
yeild thousands of bands, which can not be resolved individually . Hence, a
genomic digest looks like a continuous smear, as shown below. The one
exception is high-copy number repetitive sequences which show bands because
each copy has the same restriction sites (arrows)"
所以我的胶图显示的条带是重复性序列吗?
如果是，这又让我困惑重复性序列区间长度可能高达3kb,8kb甚至14kb以上吗?
这区间难道都没有recognize cutting site吗?
以上疑问恳请解惑，谢谢!
※ 编辑: fishg1216 (140.120.190.245), 03/27/2018 12:02:41
2F：→ Ianthegood: 重复性序列绝对可以那麽大没问题 03/27 17:05
3F：→ fishg1216: 谢谢l大!! 03/28 00:49
※ 编辑: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 10:02:16
4F：→ blence: a-32p的话,DNA ladder可用Klenow Fragment去label 03/28 11:12
谢谢b大，可否再详细说明呢?
目前我的probe制作是
1. 70 ng DNA补水至总体积10 ul
2. 100度乾浴变性 7分钟
3. 加入11 ul LS，1 ul klenow (3U)
4. 加5 ul a-32P
5. 37度乾浴反应 2小时
但我不清楚DNA ladder各家厂牌是否都适用b大你说的方法?
ps.我们实验室 DNA ladder是用 genemark
想请教ladder probe制作的详细方法。
制作完後的DNA ladder probe是否可以和我的专ㄧ性probe同时加入去标定，
还是有先後顺序之分?
最後，我目前固定用5 ul DNA ladder与sample一起跑，
想问这样的用量在做southern blot时，
标定出来的ladder讯号是否会过强而掩盖了我的sample讯号?
以上问题麻烦指教，感谢!
※ 编辑: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 13:04:04
※ 编辑: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 13:28:02
5F：→ blence: 我说的是跑胶时就加32P-labeled DNA ladder，讯号太强就减 03/28 13:46
6F：→ blence: 量或用cold DNA ladder稀释 03/28 13:47
7F：→ blence: 32P半衰期算快了,如果不鲜配,就只能每次调整比例用 03/28 13:49
抱歉，误会你的意思了! 但跑胶时就加32p-labeled DNA ladder 在我们实验室或者
放射线用的暗房都不可行，所以仅有这个方式可用吗? 谢谢!
※ 编辑: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 14:33:03
8F：→ Ianthegood: end labeling有很多方式 p32最方便 不过也可以label 03/28 16:35
9F：→ Ianthegood: 像是biotin/dig再transfer後用strep/Ab接hrp像压weste 03/28 16:35
10F：→ Ianthegood: rn一样侦测 03/28 16:35
11F：→ Ianthegood: 但是这没什麽意义啊 底片放到membrane上描marker有什 03/28 16:36
12F：→ Ianthegood: 麽问题吗? 大家western不是都这样压 03/28 16:37
谢谢I大回应，因为我的boss坚持要用label的方式呈现，否则我也想依照胶後marker
的相对位置将底片marker位置标出来，而不用这麽麻烦还去做probe标定ladder
※ 编辑: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 19:56:45