※ 引述《stephilow ()》之铭言： : 想请问一下， : 我做植物的基因转殖， : 是用农杆菌感染的转殖方式。 : 植物材料是桉树跟菸草无菌苗的叶片。 : 感染後两天叶片周围会长出细菌， : 我加入cefataxin和carbcillin清洗後， : 发觉菌量会暴增，之後怎麽洗也很清除乾菌。 : 最後是菌量过多掩盖叶片，然後叶片就烂掉死了... 菌量盖过叶片就没救了 : 请问有甚麽方法可以解决?(做了一年都没成果) : 如果是菌种污染，有甚麽方法可以可以解决? 除非你很不幸又很衰被抗cefotaxim的菌污染到， 不然听起来比较像是叶片没洗乾净。 (你转进去的construct应该没带抗cefotaxim基因吧) : 谢谢 不知道现在回会不会太晚。 不知道你是怎麽清洗的， 我有听过有人洗叶片是轻轻把叶片在无菌水上刷几回， 好像涮涮锅一样，结果当然菌一直长 XD 以下是从前实验室的韩国博後学来的， 我自己独立做菸草转基因，基本上都有一定的成功率。 一样也是感染後48小时把叶片拿出来洗， 每一组准备约350 ml的无菌ddH2O (dH2O应该也可) 另外准备乾净灭过菌的250 ml锥形瓶， (所以要事前把锥形瓶盖铝箔封口，灭菌，放凉) 把叶片从培养基拿出来，放进锥形瓶，倒入约100ml无菌水， 用力摇晃或是vortex十多秒後水变混浊，倒掉， (请善用你的镊子把叶片留在瓶口) 接着再倒入100ml无菌水， 重复用力摇晃或是vortex十多秒後水变混浊，倒掉， 接着再倒入100ml无菌水， 一样摇晃後倒掉，理论上第三次的水应该相当清澈。 把叶子取出，放到无菌的滤纸或无菌擦手纸上晾乾， 接着再把叶子放置於regeneration medium. Regeneration medium放cefotaxim 是必备， 不知道你培养基cefotaxim放多少， 我看过有人放250 mg/L, 也有人放500 mg/L, 我自己比较常放500 mg/L，毒不死菸草的，你也可以试试看。 另外切记cefotaxim的作用更接近抑制菌的生长，而非杀菌， 加上抗生素活性会随时间衰减， 请记得每3-4周就要换一次培养基，最好每次培养基都加cefotaxim, 直到长出来的小苗移进土壤为止。 (这也是为什麽有些人认为转基因菸草丢弃前应该整株Autoclave) 另外regeneration如果有那麽一片leaflet有农杆菌长出来， 请果断把那片leaflet及周围培养基一并挖除，像切除肿瘤一样。 以上希望有帮到你，有问题欢迎回文。 --

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