作者belle0625070 (云云)
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标题[求救] 关於Luciferase转染到Fibroblasts疑问
时间Wed Jan 10 06:58:11 2018
最近实验进行到将克隆在pGL3 basic里的DNA片段用Luciferase测试表现程度。
目前测试条件为：24孔板，每孔400ng DNA，1ul Lipo2000，有使用pGL4.74为对照，每孔浓度0.1ng，
在60%细胞满盘时转染，中间不换液，等待36小时裂解後读盘。
(我做的事之前实验室助理教我的，但是我有在网上查到转染时建议用没有血清也没有抗生素的培养液，
而且六小时後换含血清不含抗生素的培养液，不知道是否适合我的情况？)
老师希望我使用Lipofectamine 2000转染这些Plasmid到Fibroblasts，实验结果，最高的数字大约是六百多。
但数据老师不太满意，告诉我"the efficiency is not enough"。
想请问大家，如何的efficiency才是达到标准...
不知道这是不是一个很基础的问题，但因为是半路转行所以有一些基础知识不懂，查了文献之後心中仍然感到疑惑没有找到答案，
希望有经验的大大能帮忙回答或是指点一下方向，感谢
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1F：→ turtle24: 600多是对照组的值吗？ 01/10 07:06
2F：→ turtle24: 有很多地方需要检验，像是质体的品质，细胞本身好不好 01/10 07:08
3F：→ turtle24: 转殖 01/10 07:08
4F：→ turtle24: 如果材料跟步骤都是前人留下的又没人能讨论会比较难找 01/10 07:09
5F：→ turtle24: 原因 01/10 07:09
6F：→ turtle24: 抱歉因为网路问题好像多送出一段推文 01/10 07:10
7F：→ belle0625070: 600~1000左右是实验组的值，对照renilla大约是100出 01/10 07:13
8F：→ belle0625070: 头 01/10 07:13
9F：→ belle0625070: 老师有说过这种细胞转染效率本来就不好，但是我很疑 01/10 07:15
10F：→ belle0625070: 惑的是，那怎麽样的数据才是能够接受的 01/10 07:15
11F：→ milkpa: 用相对值，不要用绝对值 01/10 08:35
12F：→ xxtomnyxx: Renilla 太低了，这样很危险。 01/10 14:02
13F：→ xxtomnyxx: 你测测看一组只放 ffLuc 和一组只放 rLuc 去测，你 01/10 14:04
14F：→ xxtomnyxx: Renilla 读值 100 出头以 Luciferase assay 来说太接近 01/10 14:04
15F：→ xxtomnyxx: background 了。然後如果是质疑你 transfection 效率， 01/10 14:05
16F：→ xxtomnyxx: 你就做一次 transfect 表现 EGFP 的 vector，看有 EGFP 01/10 14:06
17F：→ xxtomnyxx: 表现的细胞有多少，在和前人或网路上同细胞株的实验对 01/10 14:07
18F：→ xxtomnyxx: 照，就可以知道是你转染不好还是该段 DNA 本身的 01/10 14:07
19F：→ xxtomnyxx: transcriptional activity 很差了。 01/10 14:07
20F：→ xxtomnyxx: 另外，用无血清培养基 transfection 的问题，我个人用 01/10 14:09
21F：→ xxtomnyxx: lipo2000 和 lipo3000 都做过测试，至少在我用的细胞株 01/10 14:09
22F：→ xxtomnyxx: 上几乎没有影响，不过这可能取决於培养基种类和细胞种 01/10 14:10
23F：→ xxtomnyxx: 类，比起问人得到含糊不清的答案，自己测试看看才是最 01/10 14:11
24F：→ xxtomnyxx: 有效的解决办法 01/10 14:11
25F：推 joseph103331: 我们是至少混DNA时要无血清，有些资讯甚至会连抗生 01/10 16:40
26F：→ joseph103331: 素都不建议添加，真的要试过才会知道。总之先分析 01/10 16:40
27F：→ joseph103331: 一下做相同细胞的paper选用的条件，然後再用GFP测 01/10 16:40
28F：→ joseph103331: 试转染效率，最好连liposome跟DNA的比例都titrate 01/10 16:40
29F：→ joseph103331: 一下比较好，不同细胞在做luc的时候读值也不同，我 01/10 16:40
30F：→ joseph103331: 们老师至少要求到千位，然後相对量比绝对量重要， 01/10 16:40
31F：→ joseph103331: 给你参考一下。 01/10 16:40
32F：→ blence: "600~1000左右是实验组的值，对照renilla大约是100出头" 01/10 20:25
33F：→ blence: 原po推文这句话,不像是co-transfect操作的描述方式 01/10 20:25
34F：→ blence: 也不知道100是指纯pGL4.74的值,还是pGL3/pGL4.74的相对值 01/10 20:25
35F：→ belle0625070: 补充说明一下，我每孔是加0.1ng的pGL4.47以及400ng 01/11 12:17
36F：→ belle0625070: 的DNA 01/11 12:17
37F：→ belle0625070: 感谢大家意见，明天马上先选一组DNA测试看看1ng per 01/11 12:22
38F：→ belle0625070: well renilla 在ffLuc/rLuc还有血清与抗生素移除与 01/11 12:22
39F：→ belle0625070: 否的差别。 01/11 12:22