作者MLSHBen (酷喔)
看板Biotech
标题[求救] PVDF membrane可否这样保存
时间Tue Apr 25 03:56:47 2017
大家好
想请问transfer过後还未加一抗的PVDF membrane是否可以先保存於4度1x TBST （不知是否需要先做blocking）
然後隔天再加一抗（先blocking）4度o/n
因为我的抗体隔天才会来，想先看别的位置的protein的表现
而我的抗体要看磷酸化的protein，听说磷酸化的protein不稳定
所以不知如果可以这样做，是否会影响membrane上的磷酸化protein？
查版上好像是ECL後如果要保存会烘乾，要用前先加methanol再一抗二抗
另外想问因为我会连续几天跑Western，然後这抗体会用很多次
不知是否可以第一天4度摇o/n的稀释抗体吸起来先保留在4度
然後给第二天的Western摇4度o/n
然後给第二天的Western摇4度o/n
然後给第二天的Western摇4度o/n
因为data sheet建议稀释倍率是1:1000，不知这样效果是否会减弱很多？
又学长建议我4度o/n摇後隔天室温再摇1小时来增强binding
如果这样做是否就不建议用我上述提到的reuse方法？
先谢谢大家了
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 111.248.116.194
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※ 编辑: MLSHBen (111.248.116.194), 04/25/2017 04:06:31
※ 编辑: MLSHBen (111.248.116.194), 04/25/2017 04:07:04
1F：推 moon0126: ECL後，stripping再blocking，洗乾净後直接TBST放冰箱04/25 04:25
2F：→ Ianthegood: pvdf不熟, 不过nc一抗或blocking都可以o/n, 不过没有04/25 05:07
3F：→ Ianthegood: 在看磷酸化就是了04/25 05:07
5F：→ satantaco: 有western blot的产品 代理商 捷昇生物科技04/25 09:25
6F：推 taya1991: 泡在牛奶里..一两天没问题!!04/25 09:50
7F：推 taya1991: 泡在牛奶里..一两天没问题!!04/25 09:50
8F：→ taya1991: 放TBST 可能..比较怕糊掉？ 我会放牛奶啦 参考参考XD04/25 09:51
9F：→ taya1991: 放TBST 可能..比较怕糊掉？ 我会放牛奶啦 参考参考XD04/25 09:51
10F：推 qiet: blocking O/N04/25 11:50
11F：→ qiet: 稳的04/25 11:50
所以真要这样做的话4度5% BSA blocking o/n其实是OK的？
※ 编辑: MLSHBen (140.112.4.209), 04/25/2017 13:04:18
12F：推 melaleuca: 就blocking o/n吧 BSA我会用2% 背景比较乾净04/25 14:55
13F：推 melaleuca: 磷酸化抗体一定会先看 因为都是重要data 且一般抗体通04/25 14:57
14F：→ melaleuca: 常比较强 如果烧掉就悲剧了04/25 14:57
15F：推 melaleuca: 一般一抗应该是可以重复用两三次 但每个抗体不同 需要04/25 15:03
16F：→ melaleuca: 测试 例如internal control系列我有试过十次 如果担心04/25 15:03
17F：→ melaleuca: 隔天再补一点新鲜抗体进去就好04/25 15:03
18F：→ tz2733: transfer完 没要直接blocking 就过甲醇放乾就好...要用前04/25 22:55
19F：→ tz2733: 再过甲醇 用H2O或TBS洗掉甲醇 接着就可以blocking 1Ab....04/25 22:55
20F：→ tz2733: 如果膜要放TBST里暂存 不要放太长时间(一个晚上ok) 不然04/25 22:55
21F：→ tz2733: 蛋白会掉 抗体reuse很ok 讯号变弱再加新抗体 磷酸化蛋白04/25 22:55
22F：→ tz2733: 重点在收样品时的状态 还有样品保存情况 讯号太弱就加抗04/25 22:55
23F：→ tz2733: 体浓度04/25 22:55
24F：推 Ianthegood: 专业的来了04/26 00:18
谢谢大家的建议
可以问一下收磷酸化蛋白的样品需要特别注意甚麽吗？（虽然有点离题了）
我的RIPA buffer里是有含1% protease inhibitor和1% phosphotase inhibitor
我的RIPA buffer里是有含1% protease inhibitor和1% phosphotase inhibitor
sample冻-80，但为了不增加freeze/thaw次数有考虑想要分装，然後用sample buffer冻-20 (有听说protein用sample buffer处理过後冻-20是OK的)
谢谢
※ 编辑: MLSHBen (111.248.116.194), 04/26/2017 00:54:48
※ 编辑: MLSHBen (223.137.125.118), 04/26/2017 03:33:12
25F：→ roy047: protein煮过後放-20还是会慢慢degrade 04/26 04:01
26F：推 Ianthegood: 尽快跑完罗 短期可以 04/26 05:21
27F：→ satantaco: RIPA BUFFER也要留意保存跟使用方法 04/26 09:06
28F：推 tynse71864: 能现收现跑最好罗 04/27 00:02
29F：→ tynse71864: 另 membrane若要保存较长时间， 我会丢 TBS 里 04/27 00:03
30F：→ raiyu: 小小分享 曾经牛奶4度过周末 周一来发现牛奶臭掉了 囧 05/03 22:01
31F：→ raiyu: 第2个问题 建议参考之前我在板上有问过-20能保存多久的问题 05/03 22:04