恕小弟不甚同意，一些观点供大家参考 ※ 引述《tz2733 (这就是人蔘呀~)》之铭言： : 跟老板讨论了一下这种方法是否可行 : 老板说不行... : 试着分享提到的几个观点 : 1.WB经过一抗二抗呈色出来的不是线性放大 : 所以此法不可行 : (此外 我个人的经验是 单单是曝光时间不同两个band之间的倍数差异就会不同 可能1:2 : 变成1:1.8之类) 首先这里我想问的是，贵老板不同意的是 「以western的band粗度量化来做线性normalisation」 还是 「以单一/数个protein的western band来做normalisation的概念」? 因为前者是技术问题, 我们已经积年累月的用western的band来做相对定量, 就算不准, 整体的趋势也是看得到的(up/down regulation), 虽不中亦不远矣. 如果要线性的话现在有很多CCD的机器开始可以做到,typhoon, LiCor等 如果是後者的话那我也不懂了, 如果这样的normalisation没有credibility, 那以loading量normalise 压完western後又何必再压actin/GAPDH? : 2.蛋白质浓度定量是用某胺基酸(依不同方法而不同胺基酸 这生化有教)来标准化sample : internal control则是一种蛋白质 当然是前者比较能正确标准化sample : (我表达的词可能不是很正确但希望提出来大家想一想) 我举几个极端的例子, 小弟现在在做的model最大表现量的蛋白只有一个aromatic AA 意思是这个蛋白如果暴增5倍 我测280基本上测不到这个蛋白的变化量. 你说其他方式会比较准确吗? bradford吃蛋白pI吃很凶, 你看原厂manual的范例 BSA跟lysozyme两条standard curve斜率差多少, 而且也不是线性 BCA稍微好一点但是对buffer condition的要求甚高, 你里面有点其他东西他就会给你 加一堆吸光值上去 我想要表达的是, 没有一个(至少现在)protein assay是真正准确的, 除非你家里 有一台常常保养的maldi. 我们家很龟毛的博後真的要定量还会一个sample 用三种方式定过XD : 3.会出现这种方法可能是因为收组织样本品质不一造成internal control band会粗细不 : 一 所以才用这种方法掩盖样品收集的问题 : (例如有无灌流完全 周边的脂肪组织是否有去除等都会造成internal control在等量prot : ein跑WB band粗细却不同 ) : 所以我建议原PO还是别用这种奇特的方法跑WB吧.... : paper多数都会写loading多少量的total protein 所以都是有测蛋白质浓度後等量去跑 : 的吧... : 大家参考~ 最後我想讲的是, 所有实验的所有standardisation都一样, 前提是你的target gene 必须是你当时细胞状态/体积/数量/你想要看的什麽条件的忠实proxy, 像在跑E coli overexpression的时候我想大家应该也都用OD在做standardisation RNA/qPCR你也得确定你的actin或是GAPDH这个处理下没有变化才拿来做delta delta T 如果这个条件不成立, 就算你用loading量做normalisation, 你的internal ctrl 变化量太大也一样会被鞭. 一点想法供大家参考. --

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