作者belle0625070 (云云)
看板Biotech
标题[求救] Gibson assembly连接不上
时间Tue Aug 30 01:47:07 2016
大家好，小女子最近新入行分子生物领域，请大家多多指教。最近尝试Gibson 法来克隆，但都无法成功连接，想不出原因希望能够跟大家紧急求救一下。
我的primer是由lab有经验的学姊设计的，但是这次我更换了其中F链跟R链中的酵素辨识区块，除了那六个硷基其余都保持一样。使用F+L/R+U的反应分别完成两管PCR。
Vector部分使用新设计的酵素切成线性，这个部份我确定应该没有问题。
连接时候我的疑问是，手册上面并没有读到提及PCR的产物需不需要用酵素消化，只说如果纯度有90%以上是可以不需要纯化的。意思是可以直接用PCR产物跟线性Vector连接吗？
以上是我觉得可能的问题，如果有什麽描述不够清楚的地方请告诉我我再补充。不好意思刚入门很多搞不清楚的地方，再请大家多多指教。感谢！
-----
Sent from JPTT on my iPhone
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 198.184.147.19
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1472492830.A.75B.html
1F：→ Invec: T5 exonuclease 会帮你吃 不用消化 08/30 13:32
2F：→ Invec: 通常失败原因都是linker太短 08/30 13:33
3F：→ Ianthegood: 什麽是「连接不上」? 没有colony还是false positive? 08/30 19:30
4F：→ belle0625070: 是盘子上没有菌落。 09/15 02:30
5F：→ Ice9: 所以，你的 PCR 产物没有用 RE 去切？你只切了 vector？ 09/17 09:43