作者blueness1225 (押比)
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标题[求救] western 压片背景值太高
时间Wed Aug 5 16:26:14 2015
麻烦各位帮忙trouble shooting!!!
已爬过之前的文章，也尝试之前的方法，但我western压片结果还是很脏！
样品为小鼠肝脏 protein loading量为40ug 体积10-15uL
running条件上胶60V 下胶80V 室温
transfer(湿式)条件为400mA 120min 埋冰 使用0.45孔径PVDF
blocking为Genetex blocking buffer 使用前回到室温後再blocking 30min
wash是使用Millipore SNAP i.d.2
http://imgur.com/1Acr2hv 将TBST倒入方格中wash
一抗1:1000 4度C overnight (MMP-9为Cell signaling MMP-2为St John's Laboratory)
二抗1:10000 室温 10min (Genetex rabbit)
ECL为Millipore 沥掉多余的ECL後再去暗房压片
压片为传统手洗压片
其中配制电泳胶的溶液全部都已经重新配过，上胶下胶ph值皆正常(上：6.8，下：8.8)
压片结果图
http://imgur.com/vM127W2
http://imgur.com/TqagQqc
lane的痕迹非常明显，定量会有困难。
再麻烦大家帮忙了!!!万分感谢!!!!!!!!
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1F：推 tynse71864: block改1hr? 08/05 20:24
2F：→ tynse71864: 然後1抗dilute在blocking bfr里 08/05 20:25
3F：推 tynse71864: 另外genetex bfr是哪个啊？ 1%BSA还是5%牛奶 08/05 20:28
4F：→ tynse71864: 前者会比较脏一点 08/05 20:29
5F：→ blueness1225: blocking 改1hr 但还是一样QQ 08/06 10:07
6F：→ blueness1225: Blocking buffer 是genetex commercial 的产品~不是 08/06 10:08
7F：→ blueness1225: BSA也不是牛奶~~ 08/06 10:08
8F：→ blueness1225: 谢谢你帮忙！请问还有哪里可以改进吗? 08/06 10:09
9F：→ blence: 是用SNAP id2,为什麽protocol不像它号称的时间跟步骤? 08/06 10:50
10F：→ blence: 会问你是用可能比较脏的BSA或milk,应该是需要考虑换一下 08/06 10:51
11F：→ blence: blocking bf,还是已经买了commerical就只能改blockin时间? 08/06 10:55
12F：→ blueness1225: 因为之前用SNAP id2 建议的下去做，但压片时间会拉 08/06 11:43
13F：→ blueness1225: 长非常久（20min以上），又抗体一定要溶在0.5%milk 08/06 11:43
14F：→ blueness1225: in TBST，可是压出来的band好像没有比溶在的5%BSA 08/06 11:43
15F：→ blueness1225: 那麽清楚，所以就还是ㄧ抗in BSA overnight 。block 08/06 11:43
16F：→ blueness1225: ing buffer 的话是已经买了，前一阵子压出来的都乾 08/06 11:43
17F：→ blueness1225: 净清楚，这次就突然都一直出现明显的lane，才想说 08/06 11:43
18F：→ blueness1225: 请大家帮忙看看可能还有哪些问题我没想到的，可以再 08/06 11:43
19F：→ blueness1225: 做改进！ 08/06 11:43
20F：→ blueness1225: 也再想说是否要改回使用milk blocking会不会比较好 08/06 11:54
21F：→ vetvet: 换一支纯化过的二抗，应该会有帮助改善 08/06 15:49
22F：→ blueness1225: 请问V大 纯化过的二抗是指什麽啊？？？ 08/06 15:59
23F：推 gary910729: 试试用tritonx100 0.3或0.5% 背景比较低 但signal也会 08/10 17:35
24F：→ gary910729: 相对低 还有试试preabsorbed的一抗 08/10 17:35
25F：→ vetvet: 你仔细看二抗，有的会标示辩识的Ig部位，我之前发现过 08/11 19:21
26F：→ vetvet: 同样抗mouse的二抗，H+L/L/H/Fab 这几种呈现的背景会有差 08/11 19:23
27F：→ vetvet: 在做ELISA的时候更明显 08/11 19:23
28F：→ vetvet: 另外，在抗体的data sheet上通常也会说明是否经过纯化 08/11 19:28
29F：→ vetvet: 你先看一下目前在用的二抗是什麽，再挑另一支其他的用用看 08/11 19:29
30F：→ blueness1225: 谢谢大家!!!我再试试看!!! 08/15 18:02