作者xxtomnyxx (翼天)
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标题Re: [求救] TA cloning相关问题
时间Sat Aug 1 15:34:16 2015
我做 cloning 一向都是用 colony-PCR 挑菌，
到现在从来没有遇到伪阳性，
有挑到的拿来抽 mini 都是正确的 plasmid。
只要知道为什麽会有伪阳性，
就可以设计适当的 control 来排除伪阳性，
Invitrogen 的 TOPO-TA kit 里应该会有附 M13 的 forward 和 reverse primer，
这对 primer 就可以拿来做定序或 colony-PCR，
不过我实验室是拿 T7 和 SP6 来做。
首先，
针对伪阳性的问题，
其实可以推出下面几种可能：
1. 使用的 primer 是直接放大 insert 序列。
2. 涂菌时有太多的 ligation product 在菌液里。
可想而知，
一般来说做 ligation 都会加入 vector 约 3~5 倍莫尔浓度的 insert，
所以涂在盘子上的菌液中也许会含有足以被 PCR 放大的 insert 片段，
因此使用的 primer 如果只是针对 insert ，
当然很有可能出现伪阳性。
而第二种可能则是假设接合的效率太好，
涂在盘子上的菌液中有太多 free 的 vector，
这也可能让 colony-PCR 出现伪阳性。
要排除 colony-PCR 伪阳性的问题，
首先要选择坐落在 vector 上的 primer，
这样可以避免 PCR 放大的讯号是来自涂在盘子上的过量的 insert；
再来要避免 ligation 效率太好导致的伪阳性，
只要在挑 colony 做 colony-PCR 的时候准备一个 PCR 组别，
用挑菌的工具(tip, 牙签或接种环)沾一下盘子上没有长菌但是有涂到菌液的部分，
可以沾大一点的范围以增加监别度，
用这个当作 colony-PCR 的 template，
这个组别就是 negative control，
如果这个组别有做出 PCR 产物，
那就有必要在挑出的有产物的菌落再做一次 PCR 确定讯号不是来自盘子上的 DNA，
不过如果 negative control 有产物，
但是产物量远远低於其他用菌落当 template 的组别，
基本上也不太需要担心挑到的菌落是伪阳性。
当然，
也需要比对 PCR 产物的大小，
不是只要有产物就是对的菌落。
你虽然说你的 PCR 只有一个主要产物，
但是我想你大概忽略了 primer dimer 的问题了，
Primer dimer 的分子量很低，
只要跑胶有看到一点点，
整个 PCR 产物中的 primer dimer 就有可能是你 insert 的好几倍莫尔量，
只要 primer dimer 的长度不是 3 的倍数，
一样会造成 frame shift 使的蓝白挑的 colony 呈现白色，
做 TA-cloning 至少要过个 PCR-clean up 的程序把大部分的 primer dimer 去掉，
做 gel-extraction 当然更好不过回收率又是另一个问题了......
Colony-PCR 虽然会多消耗一个 PCR 的工作时间，
但是只要能做好 control 排除伪阳性，
效率绝对比蓝白挑或直接养起来抽 mini 来的高上许多。
以我个人来说，
一个理想的 TA-cloning 行程只要 5 天：
Day 1: 早上做 PCR，中午把产物取部分跑胶，
确定有单一产物後，接着做 PCR-clean up 初步纯化产物後，
接着做 TA-cloning 的 ligation，下午就可以涂菌。
Day 2: 早上起来看菌的状况，配好 colony-PCR 的 reagent，
然後挑 colony 并上机做 PCR，
下午跑胶看结果後，选择 1~3 个阳性的菌落养在菌液并画在另一个盘子上。
Day 3: 抽 mini 取得 plasmid。将另一个盘子上的菌送定序确定序列。
同时将抽出的 mini 切 RE 确定。
Day 4: 冗冗冗～我这里送菌做定序要两天。
Day 5: 看定序结果。
其实也可以直接送 Day 3 抽的 mini 去定序，
这样只要 1 天，Day 4 就能拿到结果，
只是要赌 mini 抽到的 plsamid 的品质。
做 stick-end ligation 可能会多一天切 RE o/n，
不过大致上的流程是一样的，
给你参考参考。
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1F：推 gps0110: 推～ 08/01 15:40
2F：→ blence: 我在前面推文指的伪阳性是指colonyPCR negative那些 08/01 16:49
3F：→ blence: 与其先colonyPCR,何不提高每colony的成功率五到八成以上 08/01 16:51
4F：→ blence: 让你每颗都是对的 08/01 16:53
我个人是觉得他直接拿 PCR 产物连 clean-up 都没做就是主要的问题。
5F：推 chaunen: cPCR可以拼一次 反正早上收plate到傍晚养小量有足够时间 08/01 17:21
6F：→ chaunen: 如果挑48颗(2张24well-gel) 都没有, 就赶快找原因了. 08/01 17:21
7F：→ chaunen: 一开始做clone难免一堆troubleshooting 用cPCR比较省时 08/01 17:23
8F：推 blence: 楼上说的正是我担心的,应该调整到挑5,6颗就中,而不是放弃 08/01 17:56
9F：→ blence: troubleshooting,以为靠cPCR就能以海量筛选解决 08/01 17:59
10F：推 chaunen: 我说的是 troubleshooting完 养小量 抽plasmid来切 08/01 19:00
11F：推 chaunen: 这样速度太慢 用cPCR check 能减少很多时间 08/01 19:02
12F：→ chaunen: 每改完一次condition再来transform 养小量 至少2天吧 08/01 19:03
13F：→ chaunen: 一次又能养多少管小量? 抽plasmid的时间? 08/01 19:04
14F：推 chaunen: 照楼上说的第一批没成功 是不是又要等两天? 08/01 19:11
15F：推 chaunen: 如果有筛到 就能赶快往下做 没有也能赶快troubleshooting 08/01 19:27
对一个新手来说，
我也是觉得一开始先让他用 cPCR 筛，
之後实验再让他慢慢去改进提升成功率。
简单的说，
对一个大学部的学生就算了，
他真的只是来学东西的，
但是如果是硕士、博士生或是助理，
我只能说你在实验室是要做出成果的，
除非「如何攘 cloning 成功率从 10% 进步到 90%」能当毕业论文，
不然其实没那麽多资源(时间)给你先练好技术再往下做。
※ 编辑: xxtomnyxx (120.126.39.94), 08/01/2015 20:41:02
16F：推 lail: 请问colonr PCR遇到伪阴性的机会高吗？身边有人colony PCR没 08/02 12:20
17F：→ lail: 有产物，但抽完mini後却发现菌是对的… 08/02 12:20
有可能会遇到，
例如 insert 的序列是 GC-rich 或是会影响 cPCR 的 primer binding，
都会造成 cPCR 没有产物，
这的确是 cPCR 的一个部小的缺点。
※ 编辑: xxtomnyxx (120.126.39.94), 08/02/2015 16:29:29