作者TWX5566183 (尘世中一个迷途小五六)
看板Biotech
标题[求救] 有关於抽BAC以及PCR的问题
时间Wed Apr 15 02:17:51 2015
各位版友大家好 最近在抽BAC (约150KB) 遇到了一点障碍
首先 我是使用GENEAID的一般抽MIDI的KIT
但经过合作教授修改後在PROTOCOL上有些许的不同
首先我先养250ml的菌 隔夜後离心6000 去悬浮液後取细菌PELLET
P1P2P3各加6ml 其中P2作用十五分钟 P3也差不多作用15分钟 (无VOTEX)
接着再将白色渣给离心离掉 取上清液直接加入isopropanol等体积沉淀并离心
接着用酒精wash後风乾 使用PEQ (通column的buffer) 回溶
最後将回溶完的液体拿去过column (已用PEQ通过) 并WASH
我最後PEL elute时将PELbuffer加热到65度elute 再用同体积的isopropanol沉淀离心
最後回溶的DNA总量约是50-125ug左右 不知以上protocol是否有错误呢
另外还有PCR的问题 因为我想要在BAC上P出一段约2600BP的产物
因此我大概将30ng的DNA和PCR mix混合并跑35cycle 不过跑出来没有结果
然後我也将细菌直接去做colony PCR
不过跑出来还是没结果 老板说是因为BAC低拷贝数量的关系P不出来
不过我colony PCR跑不出来还是第一次遇到就是了...
恳请各位先进解惑 多谢各位
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1F：推 jabari: 切一切看看?? 04/15 04:10
2F：→ williamyang: 我已前抽BAC,酒精wash完,风乾回溶後就没过column, 04/15 04:26
3F：→ williamyang: 不太清楚为何要过一次column? 04/15 04:27
4F：推 chaunen: 试试PCR完再拿1ul做第二次PCR ?? 04/15 13:36
5F：→ Ice9: 先 P 个那 2600bp 内部的短片段看看是不是有产物。另外，GC 04/15 21:54
6F：→ Ice9: content 太高，也很容易amplify不出东西来。 04/15 21:54