作者godinal (无心)
看板Biotech
标题[求救] Real-time PCR positive control无讯号
时间Tue Jan 14 14:10:26 2014
各位前辈好:
自从接触Real time PCR後结果一直很不稳定, 想请问前辈们是否也有相关经验
可以稍微提点一下
原本我只是负责帮忙出"手"赶data的人...
师父先找好条件後，由我和另一位前辈负责将样品做完
我们用的是ABI7000的机台，enzyme选用Roche fast hot start Taq enzyme
一开始先捉internal control之条件
师父告知annealing 温度为72度
故反应条件则为
94度2分钟, 1cycle
94度5分钟, 1cycle
接下来40cycle则是
94度30秒, 72度1分钟
total reaction volume 20ul, Taq enzyme0.3ul
Ct值要嘛没有不然就是38-40cycle才出来
後来师父重新捉条件後，叫我把Taq enzyme改取1ul....
测试一次正常後就开始找target gene的条件了
最近重新回来做internal control之qPCR
师父说，他重新订了primer(和原本序列一样)，
annealing温度要改成64度
40cycle之条件改为
94度30秒
64度30秒
72度30秒
(hot start和上面一样)
我就像鬼打墙一样...positive control怎麽做都做不出来
和我一起执行的前辈有做出来...但她的NTC也有讯号
我试过很多次， 也试过前辈用的primer , buffer
其中也有陆陆续续换过SYBR, Buffer, dNTP, primer, templete
怎麽做都没有讯号
不知大家有什麽建议...可以提供做为参考
PS: 酒精喷太多会造成干扰qPCR的结果吗??
虽然现在喷完都会等一下才开始执行开盖的动作
但实在想不出还有什麽会影响实验结果的东西了
还有一个问题...照理qPCR条件捉好後是否还是会变来变去啊??
如果会...那要怎麽做半定量?? 如果不会....那会变来变去可能的原因是什麽呢?
烦请大家协助解惑
感恩
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.96.146.51
1F：→ roy047:Annealing温度 建议先跑gradient PCR, 以结果决定最佳温度 01/14 14:35
2F：→ godinal:意思是说原本OK的annealing温度跑掉也是正常的罗?? 01/14 16:49
3F：推 qiet:为何条件变来变去应该去问你前辈 是他改的, 正常来讲同样序列 01/14 22:42
4F：→ qiet:的引子重新合条件也不会变, 何况变这麽多根本不合理 01/14 22:42
5F：→ jsi:是全部都没讯号还是只有PC没讯号? 用的tube盖子是可透光的吧? 01/14 23:53
6F：→ godinal:前辈说条件跑掉了..以前做得出来..但现在同条件就不OK 01/15 09:01
7F：→ godinal:现在前辈归究在primer合成後没有要要HPLC check等级 01/15 09:02
8F：→ godinal:这方面我是不懂...但每次合回来Primer确实都有变数 01/15 09:03
9F：→ godinal:目前是全部没讯号..但管子和盖子是之前测试过的 01/15 09:04
10F：→ godinal:曾经做过有讯号的管子及盖子 01/15 09:04
11F：→ jsi:就近实验室找个会realtime pcr的人问问看，阅读试剂说明书，把 01/16 00:25
12F：→ jsi:原理搞清楚，才不会越做越无力，耗费时间和金钱。 01/16 00:26
13F：→ godinal:一直都有在问人...只是师父决定的东西是不大能撼动的.. 01/16 09:06
14F：→ godinal:理论上捉好条件应该可以一直重覆..光这点就是鬼打墙 01/16 09:08
15F：→ godinal:师父也只是回我...不知道...反正原本条件就做不出来..要换 01/16 09:09
17F：→ supray:看第6页 primer annealing 温度的建议 01/25 03:34