作者churchfire (别小看我...)
看板Biotech
标题[求救] Real-time PCR NTC讯号时有时无
时间Thu Jan 9 16:20:05 2014
小弟使用Roter gene 6000的real-time PCR machine.
Master-Mix为Bioline NO-ROX SYBR-Green
Total Reaction volum为20ul
检体为plant Genomic DNA
问题是:我时常NTC(no-template control, 我用灭菌的无菌水)会有singal
Ct值直逼20-35左右~~~
我的primer量也下很少，各约100nM
至於是否有primer dimer，我是使用网路上的软体设计的，我想应该没有dimer的情形
我也将product去跑电泳切胶，amplicaon size 大约100bp，
这个确定就不是primer dimer了!!
我也加上melting curve，产物专一性很高，和我其他有加template的相当
有时会有出现，一般第一次打开的无菌水(或是厂商的水)都不会有singal
但第二次用的时候就有了，或是到第三次出现!@@
也分装处理(一次用完就把那罐水丢掉)，竟然也是如此!!
请问大家有遇过这样的状况吗??
PS:我们实验室是电泳、Bench、machine都摆在同一大间实验室的那种!!
会不会是air contamination?
感谢!!
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
若是求救事项涉及实验室智慧财产(例如细胞细菌植株、质体载体等）之分让，
请务必注明贵实验室愿意设立 正式合作或 签署材料分让协议(MTA)，否则版工将迳行删除
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.69.175.253
1F：→ puec2:pipetman 污染 送去给人清吧 01/09 16:24
2F：→ churchfire:才刚清回来!! 01/09 16:28
3F：→ churchfire:有做同一时间用不同的水进行实验!!有些水有，有些无! 01/09 16:28
4F：→ puec2:那就可能是你的reagent已经污染到genomic DNA了 01/09 16:29
5F：→ puec2:reagent换新的 primer重新dilute或重订 改用filter tip 01/09 16:30
6F：→ roy047:buffer dNTP 内是否有污染? 01/09 16:30
7F：推 chaunen:sample是human的吗? 是的话操作要小心.... 01/09 22:21
8F：推 huangsw:NTC positive的melting curve温度跟产物的是否相同？ 01/09 23:45
9F：→ churchfire:是的，melting curve温度都是差一点点1-2度!!但都是同 01/13 16:41
10F：→ churchfire:一支peak的感觉!! 01/13 16:41
11F：→ huangsw:如果是这样, 那你真的要小心了, 用下一篇大大的方式抓虫 01/13 23:42