※ 引述《ai760721 (蜜汁排骨饭)》之铭言： : 各位大大好 : 事情是这样的 : 我从FFPE的sample中抽取出了gDNA : 要从里面去P某段可能有mutation的地方 : 位子是在某个基因的Promoter靠近ATG的地方约100多bp : 但是陆陆续续P了一个多月 始终都是P不出来 : 试过以下方法 : 增加DNA的量、Dilute DNA、通PCR inhibitor colume、增加primer量、增加cycle数、降 : 低annealing temperature、加DMSO、换Hot start的Taq、换过五组primer、做nested : PCR 个人建议, 1. 换polymerase. 有时後有些产物taq就是不喜欢, hot start也没有差别 2. try touch down PCR 3. 确定你的genomic DNA的品质, extraction时有没有把EtOH洗乾净 4. 确定PCR reagent是fresh的, 尤其是dNTP 5. 改变Mg浓度 (其实一般troubleshooting前几步就应该考虑Mg了) 6. genomic DNA使用前vortex程度众说纷纭. 有人是主张轻微vortex, 有人则是很极端觉得要把genomic DNA尽可能打碎到最小碎片, 所以我看过有人坚持 vortex 5分钟的. 我不认为有什麽差别--你打的再碎都还是不会比你的primer或你p 的片段小. (用sonicator要打到几百bp都需要蛮高的转速了, 你只是vortex而已) 既然你现在什麽都p不出来什麽都可以试试 我之前为了p一段1kb的产物作了三个月, 我的产物本身是tri-nucleotide repeat 如CAGCAGCAG..或GAAGAAGAAGAA..等. DNA本身自己会形成二级结构(已被证实), 所以 同领域的大家PCR都很难作. 那三个月每天除了狂作PCR外就是不停的上网查所有人家 讲的困难PCR的招式. 最後是在换了第三个polymerase (pfx)之後顺利p出来, 但还是有一定的条件, 例如genomic DNA vortex的程度, dNTP退冰的方式 (我试过, 在冰上thaw就会作的出来, 用手thaw就会作不出来) 基本上对简单的PCR有时你随便p也会有, 但困难的pcr真的差一点条件就是成与败的差别. 加油! : 通通没用 : DNA有跑过电泳 亮带大约是在400左右 : 也有P过其他基因 是可以P出来的 : 唯独我要P的这个地方怎麽P都P不出来 : 请问各位前辈 还有什麽方法可以调整的吗?? --

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