作者ai760721 (蜜汁排骨饭)
看板Biotech
标题[求救] PCR P不出来
时间Thu Nov 28 17:24:38 2013
各位大大好
事情是这样的
我从FFPE的sample中抽取出了gDNA
要从里面去P某段可能有mutation的地方
位子是在某个基因的Promoter靠近ATG的地方约100多bp
但是陆陆续续P了一个多月 始终都是P不出来
试过以下方法
增加DNA的量、Dilute DNA、通PCR inhibitor colume、增加primer量、增加cycle数、降
低annealing temperature、加DMSO、换Hot start的Taq、换过五组primer、做nested
PCR
通通没用
DNA有跑过电泳 亮带大约是在400左右
也有P过其他基因 是可以P出来的
唯独我要P的这个地方怎麽P都P不出来
请问各位前辈 还有什麽方法可以调整的吗??
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.125.33
1F：推 bluesnow1122:目标片段是多长?P不出来是没有band吗?P出来後是要定 11/28 18:18
2F：→ bluesnow1122:序吗? 你换primer是换怎样的?只是附近的位置换几个? 11/28 18:19
3F：→ bluesnow1122:要不要试试P更长一点 有P出来的话在纯化P小片段 11/28 18:20
4F：→ ai760721:目标片段 从100出头到接近300都有 11/28 18:28
5F：→ ai760721:是完全没有Band没错的 要定序 11/28 18:29
6F：→ blence:"DNA有跑过电泳 亮带大约是在400左右" 这句话完全看不懂 11/28 18:29
7F：→ ai760721:因为FFPE的DNA本身就很片段 您觉得长一点可以长到多少? 11/28 18:30
8F：→ ai760721:就是FFPE的DNA基本上跑电泳就是一片smear 11/28 18:30
9F：→ ai760721:比较亮的地方大概是在400bp左右 11/28 18:31
10F：→ blence:我会想去其他lab要个cell line的gDNA,试好条件再用FFPE 11/28 18:33
11F：→ ai760721:可是我有用其他FFPE不同case的DNA P过这东西 11/28 18:35
12F：→ ai760721:是可以P出来的 11/28 18:35
13F：推 sunnyforever:可以简述抽FFPE的方法和使用的buffer吗 11/28 19:56
14F：推 qiet:说不定真的就那麽幸运那段有deletion阿~ 11/28 20:01
15F：推 jabari:P不出来的deletion可多了..我有一段搞一年还没搞定 囧 11/28 20:33
16F：→ jabari:而且还作了MiSeq =.,= low coverage还是定不了breakpoint 11/28 20:34
17F：→ blence:看本文会觉得是FFPE不能P出来,推文又说可以,文章没说明是单 11/28 21:46
18F：→ blence:一或所有case,如果只有各别某个,你的本文就明显误导了 11/28 21:48
阿 造成误解真抱歉~ ~ 其实应该是某种cancer的部分case P我要的东西P不出来
但是其他cancer的case或normal tissue是可以P出来的 另外我也有跟老板讨论过deletion
的问题 但是他觉得block里面其实还是有一些normal tissue 应该不会全部都deletion
再加上文献都只有提到point mutation的部分 在我的目标序列里面还没有看到deletion的
案例 当然也是不能完全排除deletion的可能 所以我其实只是想问问看 还有哪些地方
是可以调整 感谢各位大大
※ 编辑: ai760721 来自: 140.112.125.33 (11/29 09:09)