作者Rarelay ()
看板Biotech
标题[求救] Cloning 反接
时间Tue Nov 5 23:23:03 2013
Hi, 大家好,
我遇到了一个 cloning 问题。
我现在正在做 GST-fused protein。
Insert 的部分，
首先我利用 SOEing PCR 的方式将 GST 和要表现的基因连接在一起後，
利用 HindIII 反应其中一端，
并利用 T4 DNA polynucleotide kinase (PNK) 反应另一端加上 phosphate group。
得到一具有一端为 sticky end (HindIII) 和一端为 Blunt end 的产物。
另外，我将载体以 StuI (blunt end) 和 HindIII 反应後，
以 CIP 去掉端点的 phosphate group。
接着，我将 vector 和 insert 以 10 fmole 和 30 fmole 的量混在一起，
以 Ligase 连接，并转入 TOP10 中。
现在我遇到的问题就是，我所有的 clone 都是反接的。
用 colony PCR 的方式确认过百个 clone，
只要用 vector 两端的 primer 均可找到目标大小的片段，
但用 gene primer + vector primer （有方向性的）就没有 PCR 产物。
然後我随机挑了 12 个 colonies 抽取质体，以 vector 上的序列引子定序，
序列是正确的，但所有 insert 都是反接的。
请问有人遇过这个问题吗？如果可以请告诉我怎麽解决的。
还是有人知道可能发生的原因？
感激不尽～
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.79.42
1F：→ lask:步骤看起来都没错 要不要先从简单的PRIMER查起 11/05 23:28
2F：→ lask:先看看当初设计的PRIMER是不是设计反了 5 3端颠倒之类的 11/05 23:29
primer 是确定没有错方向的。这部分也已经检查过了。
3F：推 milkpa:基因产物有毒，正接的basal有机会让菌不长，建议换site 11/05 23:40
这我也认为是有可能的。
事实上我 His-tag fuse 相同基因是可以表现的。
但我用 his-tag 驱动的蛋白质表现量相当大，没有变成 inclusion body,
加入诱导剂 IPTG 後生长也没有明显减慢。
这两种表现只有 tag 不同。我也切相同的切位。
4F：→ micocat:抽出来的DNA HindIII切得动吗 11/05 23:58
订序有 HindIII 的切位没错，但 HindIII: AAGCTT, StuI: AGGCCT，
看起来就算反接可能也能切开。
5F：→ ralph31567:treat klenow 硬塞进去再来挑正反接如何? 11/06 02:09
其实这件事情我做过了。两头 blunt end 连接（全部接再 StuI）还是同向的。
6F：→ xxtomnyxx:我第一个想到的是 vector MCS 上是 StuI→HindIII... 11/06 08:45
7F：→ xxtomnyxx:如果是我我会想看看定序出来的序列、vector 和 insert的 11/06 08:47
8F：→ xxtomnyxx:序列，也许能看出什麽端倪？ 11/06 08:47
9F：→ turtle24:如果insert先处理PNK 再切HindIII会有差别吗 11/06 13:30
不知道差别会在哪边。
10F：→ micocat:HindIII跟StuI是接不起来的 insert的Hd3在末端吗 11/06 14:27
11F：→ micocat:有多几个base吗？ 11/06 14:27
没有多 base。就是 MCS-HindIII-gene insert-半个 StuI-HindIII 5 个 base
12F：→ puec2:给vector, map, primer 大家帮你看一看？ 11/07 11:12
※ 编辑: Rarelay 来自: 140.112.218.76 (11/07 21:43)
13F：→ micocat:所以insert的Hd3是在末端没有加base？这样的话切不动哦 11/07 22:18
14F：→ micocat:会不会vector跟insert的Hd3都没切动 变成blunt end lig ? 11/07 22:20
15F：→ blence:我也觉得是vector MCS看反了,应该是StuI在前,HindIII在後 11/07 22:21
16F：→ blence:你先前发篇徵人启事,该lab其中一篇硕论用的就是Ecoli syste 11/07 22:25
17F：→ blence:跟你一样用fusion gene,也是His-tag的pQE vector 11/07 22:26
18F：→ blence:该vector就是StuI-HindIII的顺序(话说StuI在MCS不是很频繁) 11/07 22:27