作者chaichi (chaichi)
看板Biotech
标题Re: {求救}小鼠组织石蜡切片IHC
时间Mon Oct 21 02:32:52 2013
※ 引述《caesar0926 (呜哈哈)》之铭言：
: ※ 引述《chaichi (chaichi)》之铭言：
: : 我是在做小鼠眼睛的石蜡切片染色,用IHC来染色,使用ABC法,
: : 用脱蜡.vector的ABC之後再用DAB呈色再用hemoxylin染核,但是我染了很多次都没染出讯号
: : control(没加一抗)和有加抗体的有颜色深浅差异
: : 但从有加抗体那片我无法判断出哪里是有讯号的
: : 一片咖啡色,没有一点一点的深咖啡色讯号
: : 我在做DAB呈色时,有在显微镜下观察,且成色时间不长,所以应该不会背景太深
: : 而我染的组织前面的学长有做过同样天数眼睛的IHC有染出讯号过
: : 可以确定此组织可以染出讯号
: : 我想问这样我该怎麽办才能染出讯号?
: : 还有我想问取下组织後泡福玛铃的时间长短会有影响吗?
: : 因为一直做不出来 实在好困扰
: : 希望有人可以告诉我 谢谢
: 以前也做小鼠眼球染色(萤光和DAB呈色)
: 我觉得腊切眼球比较容易遇到的问题是 切片常常破片(lens的原因)
: 但你好像没这方面问题
: 但是有几个问题
: 1.你要看到位置是眼球哪个位置?角膜?视网膜?还是..?
: 2.你染的是什麽蛋白?正常表现状况?表现位置?
: 3.脱腊的过程也会影响你的呈色?有antigen retrieval吗?是用什麽方式?
: 你只用了两个字带过。(常常染不上去、背景值高可以改善这步骤)
: 4.抗体稀释比例也会影响背景值，也没有提供相关资讯
: 5.你用什麽固定?福马林是formaldehyde 还是 paraformaldehyde?
: 很努力看才看懂你文章 =_=
很抱歉 细节部分打的不清楚
我切片出来的结果眼睛的水晶体视网膜都很完整
要染的蛋白质出现的地方是在视网膜以及眼外肌
我是做三天小鼠的眼睛切片 是整颗头去做石蜡包埋切片
脱蜡的过程是xylenen三次, 酒精100% 95 % 75% 50% 30%进行覆水 d2dH2O
使用citrate acid隔水加热进行抗原修复,再用H2O2,然後blokcking用1%BSA
抗体比例我试过一抗1000倍.500倍.200倍二抗800倍
都没有讯号
我是用formaldehyde加上EDTA来固定
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◆ From: 114.46.217.160
1F：推 tchan:甚麽一抗可以用到1000倍？我都用50倍~150倍以内 10/21 11:38
2F：推 Dauthi:请问这抗体稀释倍率是说明书上提供的吗? 这倍率也太大了点 10/21 18:23
3F：→ vandia:我们家抗体常用到5000x还是爆讯号...看抗体啦~ 正常 10/21 21:13
4F：→ chaichi:我是按照之前做出来的那个学长的, 他是做1000倍, 10/21 21:38
5F：→ chaichi:但那是两年前的事了,我们用的抗体是自己做,的请国外纯化 10/21 21:40
6F：→ blence:自己做抗体再请国外纯化？跟一般的常理不太一样,而且纯化的 10/21 21:49
7F：→ blence:抗体可以在IHC用到1:1000? 看你要试条件,还是其实不是IHC？ 10/21 21:50
8F：推 htLiu:IHC一抗不都1:50-100吗, 1000一定没讯号 10/21 23:39
9F：推 caesar0926:先测试抗体吧 拿已经发表或已知的positive control测试 10/23 01:17
10F：推 michealking:IHC还真没看过一抗大於200的@@ 10/23 18:12
11F：→ michealking:我也推荐先测抗体还能不能work 10/23 18:13
12F：推 Realthugz:我这有1:500就可的Ab 印象中有更低的 10/26 22:45
13F：→ Realthugz:不过是冷冻切片IHC就是了 再加retrieval 10/26 22:46
14F：→ chaichi:谢谢各位的回答,我再试试抗体的条件 10/27 19:48