作者a72830044 (a72830044)
看板Biotech
标题[求救] 抽质体测ND-1000有浓度但切酵素、PCR失败
时间Thu Oct 17 22:36:41 2013
小弟日前抽学长建构的质体
菌种：E.coli 质体：ptz57r/t（含需要的基因，约1500kp，总长约4200kb）
抽质体的方法是用kit抽取
在加sol I、II、III时，变化都很明显
尤其是Sol II 样品都有变澄清，且牵丝
之後用DI水50ul回溶
去测ND-1000 选 nucleic acid 波长230nm
样品浓度约 60.8 ng/ul
260/280: 1.94
260/230: 2.08
但是我把样品拿来用NdeI切，却什麽BAN都没看到
用PCR确认（dream Taq）也是什麽都没有
program:
95度 〡 94度 60度 72度 〡 72度
3min 〡 2min 1.5min 1.5min 〡 30min
〡 30 cycle 〡
primer长度约70mer
有做过测试，在正确模版下这个条件是做得出来的
想请问为何我在做抽完质体之後以ND-1000测，在有浓度而且比值、图表都正常的情况下
做切酵素与PCR却「一条BAN都没有」或是「只有一条极淡色的broad BAN」
而不是在应该有东西地方有表示
小弟做了三组
其中有一组有好的结果，PCR有1200的BAN
另两组是怎样也做不出来
还有第二个问题就是...如果质体中仅含一个XhoI切位
我用XhoI切下去应该会变成线性的质体吧，如果切下去跑胶有两条BAN...这代表我要重新检查切位的设计了？
感谢
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◆ From: 140.123.126.147
※ 编辑: a72830044 来自: 140.123.126.147 (10/17 22:39)
1F：→ roy047:loading多少量DNA跑电泳呢? 10/17 22:51
2F：→ roy047:跑胶有两条band也可能其中一条是没切乾净...看size差距 10/17 22:52
loadind dye 1ul
sample 2ul
总共load 2ul进well里
切酵素配方：
质体样品 8ul
10X tango buffer 1ul
NdeI 1ul
切4hr後，以80度失活20分钟
load进胶片的量与上述相同
切XhoI那边是我叙述不完整
有一条没有切乾净的总长约4kb
还有另外两条分别是 2kb与 2.5kb左右
我主要是在讲 2 kb与2.5kb这两条，抱歉
※ 编辑: a72830044 来自: 140.123.126.147 (10/17 23:00)
3F：→ micocat:抽完的plasmid直接跑胶呢？ 10/17 23:04
4F：→ Ianthegood:load多一点阿 你那个浓度2ul大概本来就看不到 10/17 23:08
5F：→ Ianthegood:建议直接用vector的序列去定序 10/17 23:10
6F：→ roy047:120ng其实应该看得到了... 10/17 23:23
7F：→ roy047:第二点的话建议检查看看 也可能所抽的含有一种以上plasmid 10/17 23:25
8F：→ roy047:连PCR都放大不了 表示真的不知道抽到啥东西 10/17 23:26
9F：→ roy047:也请检查抗生素是否失效 或菌液是否摇太久 来避免摇到杂菌 10/17 23:27
原来真的会不知道抽到啥东西！
那我会再检查我所有的药品以及步骤再重新做几次确认
※ 编辑: a72830044 来自: 118.163.252.247 (10/17 23:49)
10F：推 chaunen:应该是杂菌 solution 2破菌的时候 轻轻invert几次即可 10/17 23:53
11F：→ chaunen:太用力Genomic DNA会断成较小片段 10/17 23:54
看来我摇的时候应该更小心才是
谢谢楼上各位的说明！
※ 编辑: a72830044 来自: 59.127.237.168 (10/18 01:49)