各位好 小弟是第一次发文 小弟最近一直在碰PCR的实验 我用 1% agar跑了5种基因的PCR(内染) 当中的GAPDH(ctrl组)亮度很OK 原先虽然4个基因都跑不出来 不过後来找到并试了学姊在毕业论文留下的annealing温度後 IL-13跟MCP-1也有跑出来(虽然亮度没GAPDH那麽强) 可是IL-4和TNF-a不管怎麽试都试不出来 想请各位想想应对或改进的方法 以下是我尝试过的方法: 1.cDNA加倍 2.cycle数增加 目前最高用到35个cycle 3.primer照老师的说法我们家都是用过量，所以不改(但我有重配) 4.改annealing温度 5.跑过RNA确定有东西 cDNA的OD值以及浓度也OK 最後有一个遇到的小小问题 原先我照primer送来时附的data sheet 里面的Tm值-1度当做annealing温度(毕业的学姊教我这麽做) 但P不出来 虽然後来用了学姊在毕业论文里用的anealing温度有些成 但温度却比我原先使用的高了6~7度 这是为什麽呢? 小弟只知道温度低primer会容易黏 但也容易有杂讯 麻烦各位大大罗! ----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章---- --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 36.238.181.192 第一次发文还不太会用请见谅...我原先是用gradient的机器跑 但後来教授跟我说用固定温度的方式跑跑看(结果还是一样) 此外primer我记得应该不是P全长 不过我只是个大学部学生... 不确定东西坏掉的前提下不太敢跟教授说我要订这个订那个... 以前教授跟我说过大学部的学生实验做不出来 很容易第一个就怀疑reagent之类的东西而不是实验者自己...^^" 加上我因为这问题data拖很久...(暑期计画都变成trouble shooting...) 完全没脸见教授啊啊啊((抓地 ※ 编辑: moon2040xyz 来自: 36.238.181.192 (10/03 22:23) 我没试过那种测萤光的real time PCR... 会用的学长姊也毕业了... 我们家的实验没有大家都流通... 有些技术到我就断了 毕业的学姊因为离开得很快我学不完~"~ 剩下的一位大学姊偏向做cancer所以测的基因也不一样 共通技术只知道步骤都一样 现在学新实验没人在旁边指导我都会有点担心... ※ 编辑: moon2040xyz 来自: 36.238.181.192 (10/03 22:29) J大 不太好意思 我不太了解infected sample跟mock sample 是指什麽... S大 我会担心是因为我曾经请学姊教我做ROS 然後学姊让我follow她毕业论文上写的步骤 可是我一直跑不出来 虽然和学姊再三确定过实验条件 结果却一样 後来是请别间实验室的人教我才成功 而如果有人在旁边指导，我想一来可以给建议 二来我有做错可以马上纠正 而且...我们附近实验室几乎都是跟癌症有关 而我在研究偏过敏的实验室... 如果是普遍的实验技术应该还能跟别人参考 若是只有用在研究过敏的实验可能就得参考期刊 ※ 编辑: moon2040xyz 来自: 36.238.181.192 (10/03 23:33) 加入1%的DMSO吗 这个我是没有试过 不过我跑过的那些基因 学姊以前都有成功过 虽然大概过4个月了 不过都有很好的保存在-20 所以我想primer应该也没问题 ※ 编辑: moon2040xyz 来自: 36.238.181.192 (10/04 00:04) 我的产物不管是positive还是negative control都看不到IL-4和TNF-a的产物... 原先是follow学姊留下来的条件 但今天打算用gradient来找适合的温度 而primer和template我都有重新配过了 结果还是一样 抽的RNA O.D.也没问题 用trizol抽的OD约在1.96~2.0之间 ※ 编辑: moon2040xyz 来自: 163.15.174.96 (10/04 10:35)