我回头看你的文章, 总觉得推文里的人讲的跟你在讲的好像没什麽交集 你在养的是ES cell, (human或是mouse?)基本上是养在feeder上的 但不是永远都是如此, 也是有feeder free的养法 一般来说passage ES或iPS有两种作法: 一种是enzymatic passage, 用dispase或其他collagenase类的agent 让"一团一团细胞"浮起来还是尽可能是一团 这是因为stem cell很容易死 在维持colony状况下会提高viability 另一种作法是用任何mechanical dissociation, 用pipette tip或用烧尖的玻璃管 (glass pipette拿去烧把前端烧的很尖)都是常见的作法 这原则也是一样,要尽量让细胞维持colony 从你文章里似乎你老板要你练习passage 那拿ES cell就是有违本意了 human ES cell的passage时间大约是一周上下, 但前提是你每次passage时维持colony 因为约一周後colony就会变大,大到中间开始differentiate, 所以你一定是要在显微镜下用器具"挑"掉differentiate的区块, 然後维持colony的型式passage 如果你要把ES cell打成single cell而非colony, 也不是不行, 但从一个单独的cell要长到可以passage的大小大约是3-4周 (也就是yamanaka的reprogramming所需要的时间. 我自己的project则是作gene targeting 也是把iPS dissociate成单一细胞然後长成colony也是需要约3周) 所以用ES cell练习single cell dissociate passaging蛮奇怪的 如果你一定要这麽作, 我的建议: -用accutase, 不要用trypsin, 加入5分钟後用P1000冲几下colony, 就会变成single cell -离心不要离太久也不要用太高转速. 1000rpm 4-5分钟就够了. 在作ES/iPS cells时都是尽可能的减少大量操弄以维持viability 至於你所谓的团块, 如果是肉眼所看的到的团块, 那并不是feeder (feeder的数量远少於你well里的stem cell) 而是你离心离太久或太快, 细胞很紧密的集成团. 即使是HEK, 你如果离心太久, 也很可能发生团块的现象 如果是HEK这种细胞, 我们通常是用10ml pipette把整个细胞液吸起, 接着把pipette抵在well的底部平面, 然後用力push. 用pipette和well之间的微小缝隙让细胞变成single cell跑出来 但这是用在HEK这种顽强,怎麽作都死不了的细胞, 对stem cell这种一不爽就死给你看的细胞就不太建议这样作. 以上希望对你有帮助. 还是先确定你要学的是什麽, 是一般passage的技巧,还是stem cell passage的技巧? 如果是前者, 去要个HEK之类很好养的细胞才是王道, 用stem cell来练习太奇怪了 ※ 引述《jkq (玩具)》之铭言： : 标题: [求救]请问继代细胞方法 : 时间: Wed Sep 18 14:25:20 2013 : : : 想请问大家 继代细胞时 有遇过重新回溶细胞 有打不散的情形吗: : 目前养的是 embryonic stem cell 所以下面有层feeder : 用trypsin 作用4分钟 之後 中和 离心 重新用medium回溶 : 但是 光用塑胶pipette 回溶 是没办法完全回溶 : 就还是有些细胞团块 打不散 在怀疑是不是feeder也跟着起来 : 但是dish的feeder都还在 : 也试过将团块沉淀下来 但这样细胞量 真的不太准 : 想请问看看 是否还有其他方式 可以打散团块 : -- :

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) : ◆ From: 140.128.67.246 : 推 zoom8080:Trypsin完後先用巴斯德管打一下在加medium中和试试看 09/18 17:29 : 推 aceliang:我以为ESC都是用scratch养 = =a 09/18 19:34 : 推 yuasa:加少量medium (1 cc),用1 cc Pipette打散 09/18 19:40 : 推 qiet:用2cc serological pipette 将细胞团块刮下 09/18 19:50 : 可以用刮的喔 : → qiet:继代培养ES cell应该不建议将细胞将细胞打散成single cell吧? 09/18 19:51 : 的确不能打成single 但刚开始练习 老板说先把大团的打小 single也没关系 : 推 leoblack:将trypsin离心去掉上清液後~先敲敲管子或刮刮racker~ 09/18 19:57 : ※ 编辑: jkq 来自: 114.46.156.131 (09/18 20:36) : ※ 编辑: jkq 来自: 114.46.156.131 (09/18 20:38) : 推 ljii:stem cell不就是要一团一团的passage吗???@@ 09/19 16:05 : → ljii:要练习拿HEK练习最好 09/19 16:06 : 一团一团是没错 但会变的大小不一 pa的时间点就难抓 : ※ 编辑: jkq 来自: 221.120.65.20 (09/19 21:14) : 推 marvelous13:ES要用割的！ 09/20 22:05 : 推 conective:继代就不是single cell的方式 练习打成single cell的目 09/20 22:31 : → conective:的是？ 你应该是练习打成小团就可以了 09/20 22:31 : → conective:而且用塑胶pipette打不散是正常的吧 09/20 22:33 --

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