作者galectin (半乳醣凝集素)
看板Biotech
标题[求救]Tag cloning
时间Mon Sep 9 17:31:19 2013
各位前辈们好，我想constract一个 overexpression
的plasmid，但这个基因没有市售抗体，所以想要在我的
insert中加入Flag当作tag，想请问前辈们是否只要在
foward primer当中，在stop codon前面直接加入gat tac
aag gat gac gat gac aag就可以了?
(我目前是把stop codon拿掉)
但这样一来foward primer就会有过长的问题，若是加上9个
Res site及21个mer，再加上flag就会有54个mer，这样是否
会影响PCR效率。
有看到版上前人比较推荐flag tag，想请问是否在C treminal
接flag比较不会影响蛋白结构呢?
麻烦前辈们帮我解答，感激。
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◆ From: 210.60.122.10
※ 编辑: galectin 来自: 210.60.122.10 (09/09 17:34)
1F：→ Ianthegood:做了才知道啦 都是这样 09/09 18:30
2F：→ blence:许多方法,1.是去找已经有tag的vector,2是先用两条primer做 09/09 19:21
3F：→ blence:anneal之後塞vector,或用site-direct塞,3.是你这样一起并做 09/09 19:23
4F：→ blence:先tag塞进vector的好处是以後做cloning就可以用得到 09/09 19:24
5F：→ blence:至於N或C的影响，真的是做了才知道 09/09 19:26
6F：→ soom:我以前常做跟你一样的设计，primer品质要稍注意 09/09 22:57
7F：→ galectin:谢谢各位前辈，因为已经有选好载体了，所以只能外加 09/10 15:40
8F：→ galectin:我打算选用生工primer的page纯化，不晓得品质好坏 09/10 15:42
9F：→ galectin:想再请问一下，Foward有30mer，Reverse 54个mer 09/10 15:43
10F：→ galectin:有必要把F也补齐到50个mer左右吗 09/10 15:44
11F：推 chaunen:tm值差异小於1~2度应该就可以了 我是把所有序列都算进去 09/14 18:35
12F：→ chaunen:有的protocol会只算会黏上去的部分... 09/14 18:36
13F：→ chaunen:primer可以用 禾鑫的HAP纯化 2 O.D 1mer/10元 ~3-5工作天 09/14 18:38
14F：→ alicialai:如果怕影响结构的话可以考虑加个linker在中间 09/14 23:27
15F：→ alicialai:54mer还好啦~我有一只86mer的primer.. 而且是high GC 09/14 23:29
16F：→ alicialai:照样P得出来~ 或者考虑加一点DMSO进去解掉二级结构~ 09/14 23:30
17F：推 ad1980:可以直接加入 primers 里，我都这样。 09/15 09:44