※ 引述《a72830044 (a72830044)》之铭言： : 小弟目前正要开始尝试用电穿孔法 overcross两段基因 : 大致上的流程是懂了，但是一些细部的部分不是很了解 : 从一开始拿出-70度C的菌液就不太懂 : 1.拿出菌液後置於冰上，待其微溶时取 5ul加至 5ml培养液中震荡隔夜培养 不需要等菌液"溶" 直接用tip戳一些冰块下来 丢进medium里面养即可 : 2.隔日从过夜菌液中取 50ul加入 10ml培养液中震荡培养 2hr开始每20分钟测一次OD 10000/50=200倍 有点高 我大多习惯500X稀释 : 3.待OD=0.5时冰浴10分钟，在4度C下以4000rpm离心10分钟 0.5算少 0.5~0.7都可以 : 4.倒掉上清液并以 10ml灭菌水轻轻的冲混，然後再同条件离心10分钟 这步OK : 5.倒掉上清液并以 5ml灭菌水轻轻冲混，以同条件离心10分钟 这步倒上清液的时候 pellet可能会很松 要小心 : 6.最後加入 1ml含10%甘油的冰冷溶液冲混，後以 100ul分装保存於 -70度C 要先过乾冰或者液态氮再放进-80 : 第一个疑问，步骤1 这样是可以的吗？还是要先做一些处理？ 不用 : 第二个疑问，步骤5 当中所提到个甘油溶液是甘油+灭菌水？ 是配好的10%glycerol拿去灭菌 : 第三个疑问，如果我今天要进行电穿孔法了，那含甘油的胜任细胞是直接可以使用？ 可以 : 第四个疑问，我在其他crossover的文献上有看到设计另外一段筛选的基因 : 如果是电穿孔完、涂plate然後直接送定序检查这样需要设计那段基因吗？ 有selection marker当然是比较好 要看你的用途 : 最後一个问题...小弟的质体总长度大概 8K bp左右 : 用一般的热休克法可能成功做出crossover吗？在质体上共有前後各 50bp的同源序列 : 而同源序列夹住的基因长度约 1.6K bp，欲取代位置的基因长度也约 1.6K bp crossover效率不高 所以当然是希望transformation效率越高越好 用电的比用烫的效率高了100~1000倍.. : 如果有缺条件的我会再补述 : 感谢 --

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