作者a72830044 (a72830044)
看板Biotech
标题[求救] 新手想仔细请教电穿孔法步骤
时间Wed Sep 4 01:33:10 2013
小弟目前正要开始尝试用电穿孔法 overcross两段基因
大致上的流程是懂了，但是一些细部的部分不是很了解
从一开始拿出-70度C的菌液就不太懂
1.拿出菌液後置於冰上，待其微溶时取 5ul加至 5ml培养液中震荡隔夜培养
2.隔日从过夜菌液中取 50ul加入 10ml培养液中震荡培养 2hr开始每20分钟测一次OD
3.待OD=0.5时冰浴10分钟，在4度C下以4000rpm离心10分钟
4.倒掉上清液并以 10ml灭菌水轻轻的冲混，然後再同条件离心10分钟
5.倒掉上清液并以 5ml灭菌水轻轻冲混，以同条件离心10分钟
6.最後加入 1ml含10%甘油的冰冷溶液冲混，後以 100ul分装保存於 -70度C
第一个疑问，步骤1 这样是可以的吗？还是要先做一些处理？
第二个疑问，步骤5 当中所提到个甘油溶液是甘油+灭菌水？
第三个疑问，如果我今天要进行电穿孔法了，那含甘油的胜任细胞是直接可以使用？
第四个疑问，我在其他crossover的文献上有看到设计另外一段筛选的基因
如果是电穿孔完、涂plate然後直接送定序检查这样需要设计那段基因吗？
最後一个问题...小弟的质体总长度大概 8K bp左右
用一般的热休克法可能成功做出crossover吗？在质体上共有前後各 50bp的同源序列
而同源序列夹住的基因长度约 1.6K bp，欲取代位置的基因长度也约 1.6K bp
如果有缺条件的我会再补述
感谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 118.163.252.247
1F：→ Invec:你要做E.coli的电穿孔吗? 如果是的话 1 2 3 的答案都是yes 09/04 06:24
2F：→ Invec:第四个问题如果要送的基因没有selection marker 那要怎麽筛? 09/04 06:25
3F：→ Invec:这样会挑不到单一菌落送定序 有没有考虑换小一点的载体 09/04 06:28
是要做 Pseudomonas putida的电穿孔
嗯...第四个问题我基因丢进去之後会制造PCA，我是打算配plate，加入会使PCA显色的药品
进而挑选有使周围变色的菌落
※ 编辑: a72830044 来自: 140.123.126.147 (09/04 11:20)
4F：→ Invec:电完之後记得做不同体积的涂盘 有可能菌落会长的太密不易挑 09/04 21:07
感谢，我大致上了解了！
※ 编辑: a72830044 来自: 140.123.126.147 (09/05 00:01)