※ 引述《HUVEC (老板！我要钱！)》之铭言： : 萤光的强度，除了本身标地分子表现量的高低外，还取决於其他相当多的因素。 : 例如不同颜色萤光的穿透性(红色>绿色>蓝色)，显微镜雷射与光学组件， : 抗体本身接合受体的能力，还有抗体上架接萤光分子的数量。 : 针对显微镜雷射与光学组件的影响，我多解释一下。 : confocoal对於不同萤光是用不同的雷射，光学组件(ex. filter cube)也全不相同， : 所以用不同萤光标定产生出不同的萤光量是完全可想而知的，即使你已经减去所谓 : 背景质。 : 利用confocal的萤光作定量分析本身就不是一个很准确的实验， : 即使用相同的condition(抗体相同、萤光相同、用的显微镜也要相同)下要比较 : 不同的samples是否有不同的表现量，充其量只是一种 semi-quatify : (我个人不相信这种实验数据，能造假的地方太多了)， 这倒是真的 之前也跟老板讨论说是否真的要用这种方式来呈现分子间的% of colocalization 但无奈是因为病人的检体只比米粒大一点 要做WB, PCR, realtime PCR, microarray.... 实在是无法再多浪费去做IP等实验 只能想到这种方式来呈现 还是H大及各位版友有更精简的方式可以指点一下 因为下一个计画又要开始做同样的事 挖耶起笑了......@@a : 遑论你不仅改变了萤光，又改变了抗体。 : 能得到仅有 2.2 和 2.7 的差别已经可以去庙里还愿了。 : 或许我对你的实验理解有误，欢迎讨论 : ※ 引述《mikis1107 (mikis1107)》之铭言： : : 求救求救!!! : : 之前我用confocal看双染分子的萤光量 : : 一共三个分子 A B C : : 主要目的看A+B A+C的% of colocalization程度 : : 第一次双染 A (红光,二抗是M)+B(绿光,是已经接上萤光的抗体) : : 第二次双染 A (绿光,二抗是M)+C(红光,二抗是R) : : -->我知道A应该都染同一种颜色才对 : : 但因为B与C是老板指定要呈现的颜色所以才把A的颜色换掉 : : 本来想换萤光颜色应该对於其分子的萤光表现量不会差太多 : : 但是现在问题来了!!! : : 就是有差!! : : 原本第一次双染看三组检体(NC,与其他两组病人检体) : : 萤光量比例为 1:2:2.2 : : 第二次染的检体萤光比例却变成 1:2.2:2.7 : : (萤光量都已经减去各自的background了) : : 难道同一个分子同样抗体浓度 : : 染色的condition都一样的状态下 : : (从固定, blocking,一抗浓度二抗浓度,wash时间通通一样) : : 染不一样的萤光表现量会差异到快一倍吗??@@a : : 被老板一问一整个不知道该怎麽回答~ : : 请问有concocal达人可以帮帮忙吗?? : : 有没有甚麽解释方法呢?? : : 感激不尽!! --

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