作者mikis1107 (mikis1107)
看板Biotech
标题[求救] Confocal萤光定量问题
时间Sat Aug 17 22:36:46 2013
求救求救!!!
之前我用confocal看双染分子的萤光量
一共三个分子 A B C
主要目的看A+B A+C的% of colocalization程度
第一次双染 A (红光,二抗是M)+B(绿光,是已经接上萤光的抗体)
第二次双染 A (绿光,二抗是M)+C(红光,二抗是R)
-->我知道A应该都染同一种颜色才对
但因为B与C是老板指定要呈现的颜色所以才把A的颜色换掉
本来想换萤光颜色应该对於其分子的萤光表现量不会差太多
但是现在问题来了!!!
就是有差!!
原本第一次双染看三组检体(NC,与其他两组病人检体)
萤光量比例为 1:2:2.2
第二次染的检体萤光比例却变成 1:2.2:2.7
(萤光量都已经减去各自的background了)
难道同一个分子同样抗体浓度
染色的condition都一样的状态下
(从固定, blocking,一抗浓度二抗浓度,wash时间通通一样)
染不一样的萤光表现量会差异到快一倍吗??@@a
被老板一问一整个不知道该怎麽回答~
请问有concocal达人可以帮帮忙吗??
有没有甚麽解释方法呢??
感激不尽!!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 36.238.36.127
1F：推 conective:看不太懂 3组检体是哪三组? 第一次只看A+B吗? 08/18 11:16
三组检体是Normal control(NC)
病人第一组(10位病人)
病人第二组(10位病人)
是的
第一次只看A+B
A分子的萤光(红光)
三组检体萤光比例是NC:病人1:病人2=1:2:2.2
第二次看A+C
A分子的萤光(绿光)
NC:病人1:病人2=1:2.2:2.7
2F：推 conective:即使同样抗体浓度不同抗体可能会有差异唷 08/18 11:19
一抗二抗的浓度都一样的话也会吗??
3F：→ puec2:你要不要写英文? 08/18 12:50
哈哈哈哈
我...我英文不太好@@a
4F：→ microball:你有用二抗吗？如果二抗不一样，强度不同很正常 08/18 12:54
有二抗
A分子的二抗是Mouse-FITC(绿光) Mouse-TRITC(红光)
那这样的话可以跟老板说
"因为我街的二抗不一样所以导致A分子萤光强度也有差异吗??"
但他会问我为什麽会有差异...是甚麽原因造成这种差异性..@@a
5F：推 skyofsilver:问一下 曝光强度有调成一样吗? 08/19 00:01
你是说红光跟绿光的曝光程度吗??
三组病人在各自双染的曝光程度一样没错(曝光数值调成一样)
但是第一次的红光与第二次的绿光曝光数值不一样
因为在confocal上看起来
同一个分子染红光表现量是比绿光来的弱一点点
也就是第一次双染的A分子是看起来比第二次的A分子弱一点
不过因为都是跟NC做比较
就算表现量稍微弱一点
理论上除起来的倍率应该也要差不多才对吧T__T
6F：→ puec2:倍率不会一样吧.. 08/19 10:59
7F：→ puec2:NC的强度是non-specific binding程度决定 讯号强度是 08/19 10:59
8F：→ puec2:Specific binding强度在决定.. 08/19 11:00
喔喔报告学长(姐)XDD
NC是指买来的正常组织切片
Normal control
是没有病的人类检体切片
A分子也会表现在正常组织中
只是量应该没有病人多
9F：→ puec2:不同颜色就是不同抗体 这麽多变数怎麽可以直接比 08/19 11:01
10F：→ puec2:除非你的negative control也有讯号 那就当我想太多 XD 08/19 11:01
11F：推 qiet:不同的萤光分子激发後的萤光强度会不一样 08/19 11:11
嗯嗯
我知道
但是两次染色三组检体都是同时处理
跟NC比较起来的倍率是否也应该要接近才是??
※ 编辑: mikis1107 来自: 114.137.27.122 (08/19 14:27)
12F：推 jsi:Z>7>16>2>2有讨论萤光定量。不晓得confocal跟flow是否 08/19 23:47
13F：→ jsi:类似，flow双染情况下须进行compensation，confocal就不知是否 08/19 23:48
14F：→ jsi:也要进行这步骤? 直接请教confocal specialist也是方法之一 08/19 23:51
15F：推 puec2:因为你是用比的 有没有可能第一次染色红光已经saturate? 08/20 18:12
16F：→ puec2:所以倍数拉不开 08/20 18:13
17F：→ haoen:同样一个片子 绿:红 不等於 红:绿. 08/22 18:34
18F：推 Tubar:即使你上述的condition一样 室温也是影响反应的原因之一 更 08/23 15:12
19F：→ Tubar:不用说你二抗用了不一样的抗体了 如果这样做出来的数值一样 08/23 15:13
20F：→ Tubar:我才觉得比较奇怪 08/23 15:13