各位大大好 现在我在做 medaka 的冷冻切片 及 HE染色 (之後要继续做 免疫染色、骨骼染色及细胞凋亡的染色) 但是卡在，切片一直都切不好，切片前处理条件一直试不出好的结果 (组织都会破损)(主要观察脑和眼睛) 版上的方法有参考(毕竟sample不是medaka)网路的资料也参考过，但切出来就是都不好 以及HE染色，染色前和染色後，组织会有破损的情况， 有时切片甚至在染的时候切片会掉下来(只有一部分) 所以在此想问问各位大大，有没有建议的切片前处理和HE染色的步骤，或是其他染色的步 骤 在下方我会列出我切片的处理方式和HE染色的步骤， 不知是否可以修正的地方 (本来想附上照片，但照片很多，有需要看照片的，可以提出，谢谢!) 先感谢大大! 一、切片前处理 1. 4% (paraformaldehyde)PFA + 30% sucrose，RT，8H，用Rocking shaker 30 rpm 用OCT包埋，直接放入 -80 ℃冰箱小於30分钟後切片。 厚度10 um，温度-15 ℃。 2. 4% PFA + 1X PBS + 5% sucrose + 33%OCT ， 4度C，1H → 4% PFA + 1X PBS + 10% sucrose + 33%OCT ， 4度C，1H → 4% PFA + 1X PBS + 30% sucrose + 33%OCT ， 4度C，O.N 用OCT包埋，直接放入 -80 ℃冰箱，2H後切片。 厚度10 um，温度-15 ℃。 3. 5% sucrose ， 4度C，1H → 10% sucrose ， 4度C，1H → 20% sucrose ， 4度C，1H → 30% sucrose ， 4度C，1H 用试镜纸将水分吸乾 用保鲜膜包住sample 放入 - 20度C 2H 放入 - 80度C 4H 将铝座用OCT做一个平台，OCT变白後，再加入一点OCT，趁OCT未变白前，将sample放好并 摆好位置，再用OCT将SAMPLE完全包埋住，OCT变白後切片 厚度10 um，温度-15 ℃。 4. 5% sucrose ， 4度C，1H → 10% sucrose ， 4度C，1H → 20% sucrose ， 4度C，1H → 30% sucrose ， 4度C，1H → 50% sucrose ， 4度C，3H → 用试镜纸将水分吸乾 用保鲜膜包住sample 放入 - 20度C 2H 放入 - 80度C 4H 将铝座用OCT做一个平台，OCT变白後，再加入一点OCT，趁OCT未变白前，将sample放好并 摆好位置，再用OCT将SAMPLE完全包埋住，OCT变白後切片 厚度10 um，温度-15 ℃。 5. 5% sucrose ， 4度C，1H → 10% sucrose ， 4度C，1H → 20% sucrose ， 4度C，1H → 30% sucrose ， 4度C，1H → 50% sucrose ， 4度C，3H → 4% PFA ， 4度C，1H 用试镜纸将水分吸乾 用保鲜膜包住sample 放入 - 20度C O.N 放入 - 80度C 2H 将铝座用OCT做一个平台，OCT变白後，再加入一点OCT，趁OCT未变白前，将sample放好并 摆好位置，再用OCT将SAMPLE完全包埋住，OCT变白後切片 厚度10 um，温度-15 ℃。 6. 5% sucrose ， 4度C，1H 10% sucrose ， 4度C，1H 20% sucrose ， 4度C，1H 30% sucrose ， 4度C，1H 50% sucrose + 4% PFA + 1X PBS + 33% OCT ， 4度C，3H 用试镜纸将水分吸乾 用保鲜膜包住sample 放入 - 20度C O.N 放入 - 80度C 2H 将SAMPLE 取出，放入装有OCT的TUBE盖子中，摆好位置後，放入-15度C(切片机温度)，变 白後切片 厚度10 um，温度 -15℃ ※切出来的切片直接用玻片贴片，全部切完後直接染色或放入4度C冰箱保存 --------以上是後期试过的方式，结果都不让老师满意，怎麽做可以更好呢?---------- ※HE染色 将切好的切片从4度C冰箱取出并回温 ˙玻片用(冰醋酸 5ml +甲醇95ml) 固定30秒。 ˙用DD water清洗玻片，将玻片稍微擦乾。 ˙以Hematoxylin染5秒。 ˙用DD water清洗玻片，将玻片稍微擦乾。 ˙处理85% Alcohol 1分钟。 ˙再用Eosin 染5秒。 ˙用DD water清洗玻片，将玻片稍微擦乾。 ˙用95%、100% Alcohol各脱水1分钟。 ˙放入100% Xylene 10分钟後封片(盖玻片与Permount)。 这样染色的步骤需要修改吗? 第一个步骤 用(冰醋酸 5ml +甲醇95ml) 固定30秒 会掉片是因为这步骤的关系吗?拉长时间会比较好吗? (老师觉得不是这一步骤出问题) 问题很多~先感谢大大 提出一些建议~我已经测试了两个月了~希望可以继续下去! --

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