作者puec2 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)
看板Biotech
标题Re: [求救] Dual-Luciferase 的 Internal control
时间Mon Jul 22 22:09:58 2013
真是新奇 第一次看到可以用其他promoter增强luc的表现量的做法 请问这样transcription initiation site算谁的？ 算你的promoter还是SV40 promoter? Enhancer如你所看到的也有可能干扰SV40 活性 总觉得这个方法不太对
你现在该做的就是直接测没有SV40 promoter状态下的活性 因为你是用fLic 所以我假设没有sn比太低的问题 如果活性太低可以试试看用Gausia luciferase or Nano luciferase 总之我觉得用其他promoter来增强 是很难理解的一件事
※ 引述《xxtomnyxx (翼天)》之铭言：
: 请教一下，
: 由於我所使用的 promoter/enhancer 属於较弱的类型，
: 之前教我 Luciferase assay 的老师是建议是把我想研究的基因的
: promoter/enhancer 接到 pGL3-promoter-vector 上，
: 利用上面的 SV40 early promoter 增强 ffLuc 的讯号。
: 现在我遇到一个问题，
: 如果我怀疑我的实验操作也有可能会影响到那段 SV40 early promoter，
: 也因此每做一次实验我都还要做 pGL3-promoter-vector 的 control。
: 我想问的是：
: 我能不能把 pGL3-promoter-vector 上的 ffLuc 换成 rLuc，
: 用这个 rLuc 当作 internal control 去消除实验操作对 SV40 early promoter 的影响？
: 同时 transfect 这两个有许多相同序列的 plasmid 到细胞内，
: 会不会影响我的实验结果？
: PS: 原本用的 internal control 是实验室自己做的用 UbC promoter 表现的 rLuc。
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 219.80.238.185
1F：→ xxtomnyxx:直接测没有 SV40 promoter 的部分我正在准备材料，但是 07/22 22:59
2F：→ xxtomnyxx:我觉得读值可能会低的很危险，所以先来问问後被方案。 07/22 23:00
3F：→ aceliang:hmm，gaussia是分泌型的luc，定量上要很小心。 07/22 23:13
4F：→ xxtomnyxx:使用那段 SV40 early promoter 还有一个考量，就是如果 07/23 11:38
5F：→ xxtomnyxx:我 clone 到的是 enhancer 而没有 promoter，那段序列就 07/23 11:38
6F：→ xxtomnyxx:可以用来做为我的 enhancer 的transcription initiation 07/23 11:39
7F：→ xxtomnyxx: site 07/23 11:39
8F：→ puec2:所以你不确定你的序列是不是promoter? 07/23 13:06
9F：→ puec2:如果把序列clone到pGL里面没看到活性，或者活性超低 07/23 13:06
10F：→ puec2:不就已经说明问题了... 07/23 13:06
11F：→ puec2:另外你推文对enhancer的叙述我其实完全看不懂。 07/23 13:18
12F：→ puec2:luciferase超敏感的，没有东西就是没有东西。 07/23 13:19
13F：→ blence:当然可以用SV40,可以看一下pGL3其他的vector,比较差别在哪 07/23 14:04
14F：→ blence:一般都用pGL3-basic,但你可以换成pGL3-promoter或enhancer 07/23 14:05
15F：推 windyflyer:nano很强非常强 我们家测之前三小时换medium还会有几百 07/29 14:54
16F：→ windyflyer:万的读值!不过有趣的是nano不能跟renilla一起表现 因为 07/29 14:54
17F：→ windyflyer:co-transfect的细胞刮下来测renilla会跟着飙上去.. 07/29 14:55
18F：→ puec2:哪有很强 刚刚测只有几万...-_- 算正常 07/29 20:35
19F：→ puec2:不过background很低 只有几百 可以接受 07/29 20:36