作者coco85101 (我不是李纹)
看板Biotech
标题[求救] inclusion body回融不出我的目标蛋白
时间Mon Jul 22 01:49:12 2013
各位好
我已经卡在蛋白纯化很久了
希望大家可以救救我
我目前利用pET29-target protein(有His) transform到E.coli BL21(DE3)去进行表现
IPTG induction 4hrs後
开始以 1X Binding buffer 回融菌 破菌 (sonicator 0.8/0.8 Amp37% 1hr)
*500mM NaCl , 20mM sodium phosphate
破菌後离心 分为soluble form 和 inclusion body
inclusion body再以 1X 6M urea binding buffer回融O/N
*500mM NaCl , 20mM sodium phosphate , 6M urea
隔天离心後
发现我的目标蛋白没办法回融在含6M urea的binding buffer内
学长姐以前也从来没遇过这种问题
我的目标蛋白不是膜上的蛋白,没有signal peptide , 有两个ZinC finger
也确定过已经大量表现了
且破菌时间蛮长的，应该菌都打破了阿
请各位救救我啊....
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 218.164.26.209
1F：推 puec2:菌早点收试试看。 07/22 18:51
2F：→ puec2:比如说不要induction 4小时, 做个 1, 2, 3小时 或者调整 07/22 18:52
3F：→ puec2:induction条件, 调整IPTG浓度 方向是低温 低浓度 07/22 18:52
4F：→ puec2:以前表现RNA polII CTD, 有人要我在18度induction 07/22 18:53
5F：→ puec2:忘了几小时还是overnight 照着做就出来了 07/22 18:54
6F：→ storm780121:全菌有表现吗? 07/23 23:52
7F：→ dehydrogenas:induction以後改培养的时间成28度看看 07/24 14:44