1)挑取培养皿上单一菌落，培养在 15 mL 之 LB/amp/kan 液体培养基中，以 120 rpm 转速震荡，在 37℃ 下培养过夜。 2)取上述菌液 6 mL 加入 300 mL 新鲜 LB/amp/kan 培养基中，以 120 rpm 37℃ 培养 至 A600 = 0.6 後，加入 IPTG 成为 1 mM 浓度，继续以 120 rpm 在 37℃ 震荡培养 4 h。 3)将菌液倒入 50 mL 离心管 (conical tube) 中离心 10 min (5,000 rpm)。 4)倒去上清，可将菌块连同离心管置 -20℃ 冰箱贮存。 5)取出含菌块之离心管置碎冰上，待菌块溶解後，以残存液体均匀悬浊之。再加入 10 mL lysis buffer 轻轻悬浮之。 6)将菌液放在液态氮中冷冻 1 min，然後在 37℃ 水浴中摇荡溶解之。如此反覆三次， 尽量不要产生大量气泡。将离心管的内容物倒入 50 mL 高速离心机的离心管内。 7)离心 20 min (12,000 rpm, 4℃) 取上清共 _____ mL，称为 粗抽取液 (XT)；预留 100 贡L 以便日後一起进行分析。阵此後样本均得放置碎冰上，以低温进行实验。 8)此上清加入 5 mL buffer A-0 混匀後倒入烧杯，置碎冰上放冷，不时搅拌并缓缓加入 固体硫酸铵 _____ gm，使成为 70% 饱和度，加完後再搅拌 10 min。参照 表 4.1 找出 该体积所要加的固体硫酸铵，以达 70% 饱和度。 9)离心 20 min (12,000 rpm, 4℃) 後小心倒去上清，取白色沈淀部份。 10)沈淀加以 2 mL buffer A-150 均匀悬浊之，再以桌上型离心机去除不溶物质， (10,000 rpm, 5 min)，共得 ______ mL，称为 全蛋白质 (TP)；预留 100 贡L，连同上 述 XT 置 4℃ 冷藏。 11)其余溶液部份准备进行胶体过滤层析，标示清楚後置 4℃ 冷藏。 网上查到这步骤表现蛋白，因为实验室没有超音波机。 想请问+LYSIS BUFFER破菌後离心取得上清，下面沉淀物，假如是膜蛋白有可能会在 下面嘛??是不是也要把沉淀物也拿来继续进行跟上清一样的步骤後跑胶，看有无表现 ???因为我寻问有相关经验的，他说他是IPTG诱导後，离心後用PBS溶，然後超音波 破菌20~30MIN後离心，上清跟下面沉淀都跑胶。那用液态氮破菌的，是不是也可以 直接用PBS溶，离心後上下都跑胶??就不需经过下面步骤??目前单纯看蛋白质有无表现。 感谢~~~ --

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