作者Kat0503 (米国猫)
看板Biotech
标题[求救] Western Blot 讯号很脏或是没有讯号
时间Wed Jun 26 11:44:42 2013
小妹我之前在台湾做Wetern Blot没有遇上这些问题...
怎知道到了新实验室之後就一直debug不了，希望各位出手相救 >"<
目标是要侦测分子量约140的蛋白
☆ 问题1:压片时background超高!
试过改变blocking condition如下:
5%脱脂牛奶, 5% BSA, 5%FBS, 4度o/n, 或是 室温 2~3 h 的排列组合
Buffer都是TBST
试过100V transfer 2h 或是 0.03A 4度 o/n
改变过washing的时间，从10min 3次到洗的天荒地老 (大约2~3h)
改变过2nd Ab浓度从1:1000到1:10000 室温2h
以上方法都没有用...
但是只要学长stripping掉重新染就很ok很漂亮
我问过学长的condition是5%牛奶室温1h, wash基本上约45分钟,2nd Ab 1:10000室温2h
1st Ab都是Cell Signaling的rabbit polyclonal
☆ 问题2:大分子量蛋白消失!
这次是做 22V 冰箱中 transfer O/N, transfer完的液体还是凉的(biorad湿式)
同样一片PVDF裁开，上半部染我要的target, 下半部染tublin
压片时只有看到tublin的讯号
後来用ponceu S染PVDF,确定在大分子量那边看不到band, tublin的band倒是很明显
marker完整的到PVDF上，没有残留在胶上也没有透到滤纸那边
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以上两个问题没有同时发生，
但是我真的已经不知道该怎麽做了...
不知道提供的资讯是不是够详细，请大家帮帮忙救救人在国外孤苦无依的孩子
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 98.201.148.218
1F：→ roy047:1:可附图,较好判断 2:与target size相近之marker确定有过? 06/26 11:56
2F：→ roy047:还有 你和学长用的抗体是从同一管拿出的吗? 06/26 11:58
图在学校，明天补上
与TARGET SIZE相近甚至更大的marker都有完整的transfer过到PVDF上
我跟学长用的是同牌不同管，但我本身换过两管了都是这样...
我还换过SANTA CRUZ也一样
※ 编辑: Kat0503 来自: 98.201.148.218 (06/26 12:10)
3F：→ roy047:2.那sample loading量有尝试增加过吗? 确定压得出来的量? 06/26 13:29
4F：→ roy047:也可以尝试完全照学长材料方法 或和他一起做一遍 较好debug 06/26 13:31
5F：→ roy047:会回sample量是因为ponceu S染本来protein就会分布不均了 06/26 13:32
6F：→ roy047:并不是transfer的问题 细胞不同size protein含量本来就有差 06/26 13:33
有，我是照学长的量
他压的时候SIGNAL超强的! 都还要等他稍微decay才能压得漂亮
我们试过跑同管sample，但是他的就ok我的就不行... > <"
※ 编辑: Kat0503 来自: 98.201.148.218 (06/26 13:37)
7F：→ roy047:那较可能是某个细节疏忽了orz 请他完整带你做一遍较好 06/26 13:39
8F：→ roy047:用一样材料 一样方法 一样器材这样 06/26 13:39
9F：→ roy047:因为问题点在於 如果上述步骤有误 学长应该也做不出来才对 06/26 13:44
10F：推 puec2:最近也遇到一样的问题 後来是发现 ECL没有滴乾净就直接 06/26 17:19
11F：→ puec2:包进保鲜膜压片 因为我们用得是很强的ECL 所以残留的ECL 06/26 17:19
12F：→ puec2:和free的二抗就把整片膜弄到脏脏的 06/26 17:20
13F：→ puec2:以前看讯号很强的protein没有这个困扰 压一秒就超强 06/26 17:20
14F：→ puec2:遇到需要压比较久的protein 你又用很强的ECL 06/26 17:21
15F：→ puec2:那一点点ECL残留就可以把整片膜弄得很脏 06/26 17:21
16F：→ puec2:最近一次乖乖的把ECL低乾净(NC) background就少非常多 06/26 17:22
17F：→ puec2:再不然就是最低级的错误 回去看一下TBS有没有配错 06/26 17:26
已经乖乖的把protein sample交出去给学长请他试试看~
然後已经约好时间要用他全套的东西跑一遍!
目前决定把所有buffer砍掉重练...
重配buffer之後如果还有一样的问题可能就真的要再继续找问题点了
※ 编辑: Kat0503 来自: 98.201.148.218 (06/27 12:16)