作者naruto200420 (贱仔翔)
看板Biotech
标题[求救] qPCR苦手(新增扩增曲线 MELTING CURVE)
时间Sun Jun 23 01:49:16 2013
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
我的研究题目是将实验室的基因默化香蕉转殖株内的基因表现进行分析
我取香蕉果皮与果肉的sample抽取RNA做qPCR分析其内基因表现
问题点来了，每次跑Ct值跳动有点大，我都做4重复取其中3重复，而常常发现两重复相似
= = 尤其是头跟尾为同一值，中间又是同一值，导致计算误差非常大，起初怀疑是pipet
error过大或者是RNA降解所导致，但是重作pipet稍微仔细，RNA也重抽过并有测品质，
但是一做到qPCR Ct还是不是很稳，但也不是每次都这样，总是时好时坏，实验室使用的是八连排的PCR tube，表面有雾状处理
以上是使用one step的qPCR kit所做的
接续以上，由於我要分析的基因非常多，所以考量成本换成了2 step 的qPCR kit
也就是分成转cDNA部分与qPCR部分，最近发生了有趣的事情，同一sample我以one step
kit可以测得Ct value，且扩增曲线与melting curve均正常，但是一拿去转cDNA做2 step
跑出来的结果非常奇怪，扩增曲线上不去，只扩增一点点就停止上升了，得到的Ct value
也极其不稳定甚至读不到，这原因到底是甚麽呢?我转cDNA完全照着厂商给的protocol做
，qPCR也是，已经试了多次仍然如此....
想请问大家能帮我推测原因吗?
qPCR所要求的RNA品质要到甚麽程度?
如果有需要更多资讯可以告诉我我会补上，请大家帮帮我QQ
今天我又拿之前第一次跑2 step qPCR的 sample来跑，结果居然跟失败的组合一样..
真令人崩溃...到底原因是啥...pipetman 污染? cDNA降解了吗...?
以下是图
melting curve
http://ppt.cc/KhKr
扩增曲线
http://ppt.cc/zZdi
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.230.243
1F：推 liuse:你的Ct大约都是多少?20~30?还是超过30? 06/23 04:04
2F：→ liuse:Ct越大 跳动频率也会越高 06/23 04:05
3F：→ wangba:2 step 的primer有测试过吗? 06/23 04:15
4F：→ naruto200420:Ct 通常介在20-25间，one-step和2-step所用的primer 06/23 08:20
5F：→ naruto200420:是一样的 06/23 08:20
6F：→ ltc8031:你是用那一牌的仪器和kit? two step的cDNA你有稀释用吗? 06/23 10:31
7F：→ naruto200420:我是取1ug/ul的RNA去转成cDNA共20ul，跑qPCR就直接取 06/23 14:23
8F：→ naruto200420:1ulcDNA去用了，之前有尝试稀释10倍但结果一样 06/23 14:23
9F：推 liuse:听起来你没有拉使用primer的linear curve? 06/23 14:26
10F：→ Ianthegood:2step先去拉个50-65 06/23 18:37
11F：→ naruto200420:测primer efficiency吗 06/23 20:11
12F：推 chaunen:先做个普通PCR看看有没有band? 06/23 21:00
13F：→ a90648:1ul体积太小了光pipetting error就会让你数值乱跳 06/24 09:34
14F：→ naruto200420:那要调成多少呢 06/24 13:43
15F：→ naruto200420:2 ul够吗 06/24 16:21
16F：→ a90648:我们家是稀释10倍取5ul给你参考吧 06/25 09:19
17F：→ roy047:pipetman也拿去校正一下?QQ 06/25 09:36
18F：→ naruto200420:可是厂商的protocol写cDNA体积不要超过总体积的1/10 06/25 11:27
19F：→ naruto200420:我用的kit总体积为25 06/25 11:27
20F：→ a90648:你们是用哪套Kit，说出来也比较好解决 06/25 12:35
21F：→ naruto200420:Labstar qPCR kit 06/25 13:46
22F：→ naruto200420:转cDNA是用biolab的 06/25 13:49
23F：→ naruto200420:来po图让大家看扩增曲线 06/26 10:54
※ 编辑: naruto200420 来自: 140.112.89.223 (06/26 18:25)