作者EDONIS (ED)
看板Biotech
标题Re: [求救] 钓出全长序列，未知基因
时间Sun Jun 9 04:36:25 2013
请问，老师说我必须抽 genomic DNA做Southern blot,
将promoter, introns片段clone出来, 序列读出来,
怎麽办!!我完全不懂Southern blot找全长??
跪求ORZ!!
※ 引述《puec2 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)》之铭言：
: ※ 引述《EDONIS (ED)》之铭言：
: : 请问由於用cDNA library的方法 CLONE到一段序列
: : 是片段序列，老师希望我能把这序列的全长拿到!!
: : 在去比对看是甚麽。请问这能RACE的方法来做吗??
: : 还是??
: 假设你找到的东西在Genebank上面没有
: 那你可以...
: 1. 丢BLAST找最接近的基因(总不可能是你排骨开天第一人吧)
: 2. 用找到的已知基因去做BLAST後 取最接近的前十个hit做multiple alignment
: 3. 找到conserved region(总不能可能你是排骨开天第一人吧)
: 4. 从 conserved region设计primer 如果conserved region不够长就设计
: degenerate primer primer的3' 最好是放在conserved region上面
: 5. PCR, TA cloning, sequencing
: 6. RACE有点麻烦 其实不用这麽麻烦的
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 123.195.13.23
1F：→ Invec:你之前不是有说过要做RACE? 老板不接受吗 06/09 05:02
2F：→ EDONIS:不接受!!叫我用Southern blot，我完全不懂怎麽用>"< 06/09 18:51
3F：→ e5f6:Southern blot怎麽求全长 真不可思议 06/12 14:14
4F：→ Invec:老板可能看过 "第一次做DNA就上手" 这种书吧 06/12 19:44
5F：推 puec2:用southern钓全长是传统方式 06/12 20:21
6F：→ puec2:先跑southern用原po的fragment当probe 06/12 20:22
7F：→ puec2:理论上只会出现一到两个band 然後再跑一次southern 06/12 20:23
8F：→ puec2:把band相对应位置的gel挖下来去做cloning 06/12 20:23
9F：→ puec2:因为是southern 所以理论上上面的band都是有切位的 06/12 20:24
10F：→ puec2:直接塞进vector就好 06/12 20:24
11F：→ puec2:得到的整盘colony再去做colony hybridizaion 找出带有 06/12 20:25
12F：→ puec2:一样是用原po的fragment当probe 这时候会有讯号的colony 06/12 20:25
13F：→ puec2:里面就有可能带有全长 06/12 20:25
14F：→ puec2:最後对应回去 把colony挑起来 放大 抽plasmid 06/12 20:26
15F：→ puec2:就可以了 06/12 20:26
16F：→ puec2:southern我知道可以用dig 06/12 20:28
17F：→ puec2:colony hybridization以前看人家都用isotope做 06/12 20:28
18F：→ puec2:因为dig出现的时间点 大家都转向做模式生物 都是有genome的 06/12 20:29
19F：→ puec2:现在还能做到这种实验 难得阿 难得 06/12 20:29
20F：→ puec2:新手搞这个要搞一年吧 06/12 20:30
21F：→ puec2:然後参考的方法和paper的作者应该退得退 死得死 XDDDDDD 06/12 20:30
22F：→ e5f6:做得顺手的一个流程也要各把月了，这方法真是匪夷所思XD 06/12 20:53