※ 引述《lxz (梦与天空交织的瞬间)》之铭言： : 请教各位板友前辈 : 我最近在做Co-IP，先用100ul的protein A sepharose beads与1ug的抗体做conjugation : 之後再去抓protein，之後用等体积的2x sample buffer配成sample : 但是跑完WB的时候去照胶发现band都不水平... : 我有把体积调成等量了 : sample煮完之後也利用离心把beads尽量去除了 : (我会把sample先离心，把液体吸至新的tube在离心一次，然後只有取40ul*2次出来load : gel，且都从液面开始吸) : 但为什麽我WB的band都会歪歪斜斜的不在同一条水平线上呢>"< : 是不是跟transfer也有关系呢? : 我把gel放到membrane(NC)上时会用滚轮赶泡泡，这样会造成影响吗? : 我们是用Bio-Rad的transfer machine ( http://ppt.cc/IGQ9 ) : 由於要看的蛋白很大，Transfer时间较长，有时候gel会烧焦，这也会影响吗@@? : 谢谢大家~烦请解惑<(_"_)> CoIP, 2X sample buffer 我猜你loading的量应该很大吧 以前是有遇过Stacking gel太短 Sample太多 跑出来的Band就会很肥 因为後面的来不及跟前面的压成一条线 前面的protein就往前跑了 所以你用高%的Resolving GEL不会看到 就可能是因为前面的跑得比较慢 可以等後面的protein一起往下跑 如果真的是因为Stacking gel太短 你的band歪斜的形状 可能跟你Well底部气泡造成的破裂形状很像 Stacking gel太短是人之常情 用到低%的gel就是想要让Band分开一点 是很常见的失误 :) --

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