作者lxz (梦与天空交织的瞬间)
看板Biotech
标题[求救] WB的band不平
时间Tue May 28 23:38:19 2013
请教各位板友前辈
我最近在做Co-IP，先用100ul的protein A sepharose beads与1ug的抗体做conjugation
之後再去抓protein，之後用等体积的2x sample buffer配成sample
但是跑完WB的时候去照胶发现band都不水平...
我有把体积调成等量了
sample煮完之後也利用离心把beads尽量去除了
(我会把sample先离心，把液体吸至新的tube在离心一次，然後只有取40ul*2次出来load
gel，且都从液面开始吸)
但为什麽我WB的band都会歪歪斜斜的不在同一条水平线上呢>"<
是不是跟transfer也有关系呢?
我把gel放到membrane(NC)上时会用滚轮赶泡泡，这样会造成影响吗?
我们是用Bio-Rad的transfer machine (
http://ppt.cc/IGQ9 )
由於要看的蛋白很大，Transfer时间较长，有时候gel会烧焦，这也会影响吗@@?
谢谢大家~烦请解惑<(_"_)>
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 111.250.122.24
1F：→ xxtomnyxx:Western blot 的结果图呢？有图片比较好判断问题点。 05/29 00:38
2F：→ xxtomnyxx:不过你说的歪歪斜斜，是每一条 band 个别都歪歪斜斜， 05/29 00:39
3F：→ xxtomnyxx:还是所有的 band 连成一条斜线或有弧度的线？ 05/29 00:39
图要等我下班才方便放上来，我晚点放，谢谢您^^
Sorry~昨天太忙，今天附上图片
http://ppt.cc/6Bd- 谢谢~
4F：→ blence:假设你用这台,用他整套transfer耗材,那张gel很容易变形就会 05/29 02:52
5F：→ blence:歪斜,可是你说会烧焦,推测你用自家耗材,你的蛋白应该过的不 05/29 02:53
6F：→ blence:完全,当然,会变形也跟为了跑大蛋白才用低％的gel有关 05/29 02:54
7F：→ blence:不过你应该也会在WCE看到不平整现象,不只是IP-martics 05/29 02:55
後来想想应该不是这个问题，因为跑一般WB不会这样，还是谢谢您^^
※ 编辑: lxz 来自: 111.250.122.24 (05/29 08:21)
※ 编辑: lxz 来自: 111.250.101.97 (05/30 23:36)
8F：→ blence:看起来是％相关阿,而且每个well的PSB浓度不一样加重了 05/30 23:53
这麽严重的歪斜确实只出现在低%的Gel，在sample buffer的部分也不一样
input(左)及PC(右)都是加5x sample buffer去配，但beads pellet是用2xSB，且来源不同
跟同学讨论的结果可能是盐类浓度不一造成
※ 编辑: lxz 来自: 111.250.101.97 (05/31 08:20)