作者ai760721 (蜜汁排骨饭)
看板Biotech
标题[求救] RE digestion
时间Thu May 23 08:40:52 2013
各位前辈好
最近在cloning的时候出现很诡异的问题
我所使用的是pEGFP-C3的plasmid
因为实验需求
须把EGFP部分以AgeI跟BglII切下
然後用klenow切平在self-ligation
但是诡异的事情出现了
我用酵素作用完跑胶然後把上面的Band切下做klenow(此时确定EGFP的band有切出来,
有看到清楚EGFP的band)
然後self-ligation, transformation, mini-culture後
想说用ApaLI跟EcoRI确认一下，去掉EGFP之後应该会得到一个约1Kb的band
没想到竟然出现1.7K左右的Band
这不就是EGFP又长出来了ㄚㄚㄚㄚㄚ
至此实在是百思不得其解....
有没有哪位前辈有这样的经验可以指点一下!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.125.33
1F：推 HEK293:就，你纯化的所谓「上面的band」，里面还是有很多没切乾净 05/23 08:54
2F：→ HEK293:我个人认为4.7k与4.0k是无法分辨的两条 05/23 08:55
3F：→ HEK293:所以他没有又长出来，是你根本没切掉。 05/23 08:55
4F：推 mesenchymal:推HEK大 05/23 10:49
5F：→ puec2:多挑几颗吧 05/23 20:09
6F：→ ai760721:挑了16颗挑到一颗了!! 05/27 18:54
7F：推 puec2:恭喜~ 06/05 11:52