前情提要： 目前手上正在接一个 vector 9.6K/insert 1.5K 的construct vector使用割胶回收取得 inster使用PCR取得 以molar ratio I:V=3:1 的量 使用T4 ligase室温作用3小时後转到JM109 heat shock後涂抹在LB+Amp的固体培养基 o/n之後 培养基上有长出菌落 （我有作vector only的培养基 没有长） 挑将近10个菌落作colony PCR（同时也有另外涂一盘保留，以下称plate-B） primer一条使用vector上的 一条使用insert上的 跑胶後在正确的位置上有出现明显条带 -----问题开始--------------------------------------------------- 为了再次确认是否得到正确construct 我挑了Plate-B上的菌落 用liquid LB+Amp养小量 想抽plasmid 再用限制酵素去切确认片段大小 奇怪的是 我Plate-B上的菌落丢到liquid LB+Amp 12个小时之後什麽都没长 再挑几个菌落去作也是一样什麽都没长出来 我确定我液态跟固态培养基所使用的Amp浓度是一样的 （而我同时也有进行另一个construct 使用同一罐液态培养基结果很正常） 因此还烦请版上有经验的朋友多多给我意见 我还不想放弃这次的结果Q_Q -- ◣◢ ◣◢ ◣◢ ? ◣◢ ………… ◣◢ ◣◢ ╯╰ ◣◢ ◢──◣ ◢──◣ ◢──◣ ◢──◣ ◢──◣ ◢──◣╮╭ ◢──◣ ◥ ◤ ◥ ◤ ◥ ◤ ◥ ◤ ◥////◤ ◥ ◤ ◥ ◤ ～ ～ ﹀ \ ＜ \ / / 要有 ＜ ＞ ﹀﹀╯│ │ V V 礼貌欧 ▼ ┴─┴ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 118.168.64.47 请问同时涂两盘的意思是？虽然我也不觉得plate-B是杂菌XD 如果是false-positive band的话 养菌是不是应该还是可以长得起来？ 但後续用酵素确认会切不到正确的大小这样 另外也非常非常感谢您的建议 我明天再试试看！ ※ 编辑: lucky1300 来自: 118.168.64.47 (04/24 22:21) 嗯嗯是的 感谢提醒一时打太快没注意！ ※ 编辑: lucky1300 来自: 118.168.64.47 (04/24 22:27) 我作的顺序是用tip从原始那盘挑一个菌 在另外一盘（plate-B）划一道 再来就直接在加好PCR药剂的tube里搅一搅这样 不好意思没有讲清楚 我之前有接过几个大於10K的plasmid 因为JM109用得顺手所以就一直使用也没去看手册囧 非常非常感谢B大的提醒 ：） ※ 编辑: lucky1300 来自: 118.168.64.47 (04/24 22:36) 从大家过去的经验我猜应该是vector的影响比较大 那我会再去看看原始的vector是被转到哪个菌里 非常感谢您的热心！ ※ 编辑: lucky1300 来自: 118.168.64.47 (04/24 22:44) ※ 编辑: lucky1300 来自: 118.168.64.47 (04/24 22:45)