发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出 以方便板友帮您追踪问题 ----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章---- 大家好 小弟最近在做western的实验，遇到了鬼打墙的瓶颈...T_T 我的protein在经过X光压片後，会出现如以下图的状况... 图片连结：http://ppt.cc/gZaF (X光片压片时间1分钟) 我的protein们会毛毛的 但是隐隐约约还可以看见其中的band... 感觉就是protein有点散开 有出现光晕的那种FU 而且相同的protein以前压的时候大概30秒讯号就很够了 而且很集中 但是现在要压到3分钟讯号还没有那麽强 而且散开 又糊糊的 但是PVDF上面的marker却是很sharp，没有糊掉的状况 想请问各位版上的大人们 是否可以给小弟一点建议 指点一下迷津 因为困扰了很久 想说来向各位前辈们求教了 感激不尽 以下为我的western 条件 protein loading 量: 30 protein loading 体积: 20-30 uL 开始跑胶前，会先pre-run: 80V 10min Running条件: 60V upper gel, 80V lower gel, 总共时间~150min，室温 ↓ Transfer条件: 300 mA, 2 hour, 0.45孔径的PVDF, 埋在冰块里面转渍 ↓ Blocking: 5% BSA or 5% skim mlik, 室温1小时 ↓ Wash: TBST with 0.1% tween-20, 5次, 每次5分 ↓ 1st Ab: 稀释倍数如厂商建议量，4度C, overnight ↓ Wash ↓ 2nd Ab: 稀释倍数10,000-20,000x，确认二抗没有用错 ↓ Wash ↓ 压片：片子在投影片上摆好，ECL先混好再淋上去，擦乾多余的ECL，盖上投影片压片 (洗片为自动洗片机，自动洗片机确认没有问题，因为其他实验室同学都OK) 有劳各位前辈了 真的是万分感激 小弟在这边先向各位致上最高的的谢意 感激不尽!!!!!!! --

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