作者a14743535 (pig)
看板Biotech
标题[求救] transform
时间Sun Apr 14 21:02:23 2013
请问一下版上的各位先进
我们家的competent cell是跟厂商买的不是自己做的
我在做的时候会习惯将一管100ul competent cell分成五管来进行
也就是这五管分别加入不同molar ratio的ligation product
但都没有长出任何的colony
在想是不是要改一成一管100 ul competent cell一个molar ratio
我想请问competent cell的量是否会有影响呢？
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 124.11.132.89
1F：→ lask:当然有，但是跟ligation product也有关 04/14 21:17
2F：→ a14743535:ligation的部份有跟老师讨论研究过了~应该是没有问题 04/14 21:26
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.132.89 (04/14 21:27)
3F：→ blence:我以为分很多管是常态,通常这样做不出来会是其他问题 04/14 22:22
4F：→ a14743535:我也以为是常态XD 04/14 23:01
说一下目前的情况
insert(900bp)成功接进yT&A当中
用两个限制酶(Xba I，Cla I)将insert切下再接入另外一个vector(pBK-CMV-Gal4)中
vector的部份是先以Cla I作用两小时，跑胶确认有没有切乾净
再以Xba I作用两小时，切胶纯化
进行ligation，molar ratio 1:2 ~ 6
4度C overnight，70度C中止反应(ligation product有跑胶，出现DNA ladder
老师说这样是有发生ligation)
进行transform
用HIT competent cell(100uL/tube)
以tap water解冻至1/3融解
分装成五管，每管20uL
取小於等於competent cell体积10%的ligation product(2uL)加入competent cell
vortex 1s
冰上反应5分钟
涂盘，37度C培养overnight
隔天就什麽也没看到...而且我还有做一管是完整的plasmid去进行transform
结果也什麽都没长...
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.136.149 (04/14 23:25)
5F：→ blence:pBK-CMV是Kan吧,HIT,YB这些快速transform的遇到Kan最好能找 04/14 23:42
6F：→ blence:照以前revovey放置30min比较好,而且Kan也尽量25ug/ml以下 04/14 23:43
7F：→ joey0715:ladder的位置正确吗 gel底部能否看到insert 04/14 23:52
8F：→ joey0715:另外冰上反应有敲吗，建议反应完做一下recovery 04/14 23:56
9F：→ a14743535:@blence我Kan是用25ug/mL，谢谢建议 04/15 00:00
10F：→ a14743535:@joey0715 少打一个XD，冰上反应前有vortex 1s 04/15 00:01
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.136.149 (04/15 00:01)
11F：→ huuban:我们养DH5a会有42度45秒的步骤再冰上1分..不会直接涂盘耶@@ 04/15 00:02
12F：→ a14743535:我是都照厂商给的protocol 04/15 00:04
13F：→ a14743535:ladder的位置有没有正确我不知道@@，接起来也不是环状 04/15 00:05
14F：→ a14743535:所以我不知道怎麽看...但insert是看不到的 04/15 00:05
15F：推 ithinksoiam:不然试试看培养液 recovery 1hr 後再涂盘勒 04/15 08:40
16F：→ a14743535:想请问一下recovery的时候要不要shaking 04/15 13:19
17F：→ joey0715:circular的话会在total大小上下共有3个band 04/15 13:24
18F：→ joey0715:有check marker是否跑掉吗，recovery大约1ml就够涂前浓缩 04/15 13:29
19F：→ a14743535:在那附近有好多band... 04/16 09:39
这次多加了个recovery 30min的步骤
control组(完整的vector)有长出来了
长满满的
可是实验组却还是一颗都没有长...
好难过...
※ 编辑: a14743535 来自: 140.112.79.120 (04/16 09:41)
20F：→ kunhan1013:42度 heat shock? 04/16 10:34
厂商protocol上没说要heat shock
还是我要多加这一步？
21F：→ huuban:胶图拿出来大家讨论吧 04/16 10:37
http://photo.xuite.net/a14743535/6260888/1.jpg
以上是我的胶图
vector是4700bp insert约850bp
※ 编辑: a14743535 来自: 140.112.79.176 (04/16 11:24)
22F：推 a90648:多做个heat shock试试看? 04/16 11:24
23F：→ a90648:vector only切完有那麽多条，是原本有接东西在里面? 04/16 11:29
我的vector上面原本就已经有个Gal 4接上去
vector only是在做ligation的时候DNA只加经过double RE digest的vector不含insert
然後这个vector是用切胶纯化下来的
※ 编辑: a14743535 来自: 140.112.79.176 (04/16 11:47)
24F：→ huuban:没碰过会ladder的，也没碰过接不是环状的@@ 04/16 13:24
25F：→ huuban:怎麽确定有接上的呢？ 04/16 13:30
26F：→ blence:为什麽vector only经过XbaI跟ClaI切过会有这麽多band？是切 04/16 13:56
27F：→ blence:胶完纯化後才跑胶吗？ 04/16 13:57
我也不知道为什麽会有这麽多band@@
我是将vector先以Cla I切再以Xba I切之後跑胶纯化
再将纯化出来的取一点出来
加入buffer A 1
buffer B 1
vector 3
ddH20 4
ligase 1
---------------------
total 10uL
再跑胶後就变那个样子了
28F：→ blence:你们老师说的ligation product有出现ladder才算lgation发生 04/16 14:00
29F：→ blence:这句话问题很大,一般transform会成功的用量,跑胶根本看不到 04/16 14:03
30F：→ blence:他可能指是制造特殊nt的plasmid从linear接成ccc的评估方式 04/16 14:06
※ 编辑: a14743535 来自: 140.112.79.176 (04/16 14:27)
31F：推 puec2:为什麽有两个 buffer? 04/16 17:01
32F：推 chaunen:益生的bufferB是用来增加blunt end 的ligation效率. 04/16 19:21
33F：→ chaunen:addgene的database中pBK-CMV上有两个ClaI site. 04/16 19:38
34F：推 chaunen:建议:1. 分别用xbaI ClaI 做single cutting 然後跑胶 04/16 19:43
35F：→ chaunen:和uncut 相比, 应该只剩1条4.7kb的band. 04/16 19:46
36F：→ chaunen:表示plasmid上应该只有 "1个"XbaI or ClaI site 04/16 19:47
37F：→ chaunen:并且这2种RE enzyme还是好的, 不用买新的. 04/16 19:48
38F：→ chaunen:而inser可以从TA clone上切下, 表示这两个cutting site 04/16 19:51
39F：→ chaunen:也是OK的. 到此, inser & vector制备应该是没问题的. 04/16 19:53
这里建议的部份，都已经有做过了，没什麽问题。
40F：→ chaunen:2. ligation 时的bufferB可以不用加. 04/16 19:57
41F：→ chaunen:3. ligation product通常比plasmid还难transform (难很多) 04/16 20:00
42F：→ chaunen:ligation product和competent cell增加,ex: 40ul to 100ul 04/16 20:14
43F：→ chaunen:heat shock 後可加 SOC medium recovery, 增加efficiency 04/16 20:16
这边因为厂商的protocol没说要heat shock
所以大大的意思是要我自己多加个heat shock的步骤吗？
44F：→ chaunen:plate就多涂几盘. 04/16 20:17
45F：→ chaunen:补充 益生YB ligase RT(22-25) 1-2hr就OK了 04/16 20:18
46F：→ chaunen:ligation完最好能跑PCR check, primer设计需跨inser or 04/16 20:21
47F：→ chaunen:一条primer在inser上, 另一条在vector上(跨cutting site) 04/16 20:22
48F：→ chaunen:避免伪阳性. 04/16 20:22
49F：→ chaunen:pBK-CMV上可以使用M13 forward, reverse primers来完成 04/16 20:23
50F：→ a14743535:请一下SOC medium可以改用LB吗？因为我们家没有SOC 04/16 20:24
51F：推 chaunen:SOC可以自己配阿XD" 04/16 20:27
52F：推 chaunen:tryptone 2g; yeast extract 0.5g; NaCl 0.05g;KCl 0.019g 04/16 20:31
53F：→ chaunen:pH调到7.0 灭菌後冷却,再加 2ml 1M glucose(sterile) 04/16 20:33
54F：→ chaunen:我觉得先check vector plasmid比较重要@_@ 04/16 20:34
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.136.149 (04/16 21:38)
55F：推 chaunen:我觉得加heat shock比较好, 42度C 45s, on ice 10mins, 04/16 22:10
56F：→ chaunen:加5X体积的SOC medium 37度 shack 1hr(recovery) 04/16 22:10
57F：→ chaunen:我用过益生的ECOS DH5a 是OK的. 04/16 22:11
58F：→ chaunen:vector cutting时, 若切下的片段<50mer 不用切胶纯化 04/16 22:13
59F：→ chaunen:直接clean up 即可. 04/16 22:14
想请问一下这里是会有什麽影响吗？
60F：→ chaunen:不过transform时需做vector only (no ligation)的control 04/16 22:15
61F：→ chaunen:当然vector only 的 ligation 也要做. 04/16 22:16
这里我都有做
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.136.149 (04/16 22:33)
62F：推 chaunen:个人觉得经过切胶纯化回收率比较低. 04/16 23:19
63F：→ chaunen:一般spin column抓不到~45mer以下的短片段 04/16 23:20
64F：→ a14743535:只是单纯回收率的原因就是了XD 04/16 23:21
65F：→ chaunen:是XD" 04/16 23:24
66F：→ chaunen:我觉得要先PCR check ligation product 04/16 23:26
67F：→ chaunen:若没接进去 transform再多也是白搭XD" 04/16 23:26
68F：→ a14743535:就取个约1uL跑PCR吗？ 04/16 23:48
69F：→ blence:用PCR check ligation product完全没必要,buffer condition 04/17 01:06
70F：→ blence:不见得适合taq,而且10^8的效率都没有,那更没有PCR出场必要 04/17 01:11
71F：→ blence:HIT是学YB的,原po在transform可以找YB的网页TM参考,heat sh 04/17 01:15
72F：→ blence:有较眼前方法更佳的效率不妨调整,vector的部分,你的图根本 04/17 01:17
73F：→ blence:看不出two RE切完後呈现single 4.7k的样子,或许你有确认？ 04/17 01:20
http://photo.xuite.net/a14743535/6260888/2.jpg
这个图应该看的出来吧@@
74F：→ blence:上面有提ClaI有两个site就去翻map,晕倒,你知道切到什麽吗 04/17 01:36
75F：→ blence:如果你是bcakbon是stratagene的pBK-CMV,上面方法都不用试了 04/17 01:39
怎麽说？
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.139.25 (04/17 01:41)
76F：→ a90648:你手上应该有pBK-CMV-GAL4的map吧!!先看一下ClaI切在哪 04/17 09:22
我只有单纯的pBK-CMV的map...
ClaI在pBK-CMV上确实有两个切位是在1036bp跟4028bp的位子上
如果两个切位都被切到
那应该会有约3000bp跟约1500bp的片段
可是在我只单用ClaI 切的时候
并没有看到这两个片段
我也有去查过Gal4的切位
上面都没有XbaI或ClaI的切位
※ 编辑: a14743535 来自: 140.112.79.176 (04/17 09:53)
77F：→ a90648:那就对啦!!这就是现在怪异的地方，先确定你拿到的vector 04/17 12:01
78F：→ a90648:是不是对的罗!! 04/17 12:01
79F：→ a14743535:是送定序? 04/17 12:41
80F：→ blence:送订序...新手要先学习MCS没写的就不该用,除非你很熟 04/17 13:14
确实是没很熟@@
只是实验是由学姐设计的
後来才交给我做的...所以有些部份也不是非常清楚
81F：→ blence:而且双切後的应该4.7k,前面就提了你也没检查过这个结果 04/17 13:16
检查这个结果?
这里我想请问一下该怎麽检查
因为单切在上面我有再附一张胶图了
而双切我是没有另外再拍下来
大小也是在那个位置附近
82F：→ blence:另外,你的图若使用快速dye也应该要了解有何缺点,问题太多了 04/17 13:19
83F：→ blence:了解Gal4在pBK的MCS位置,换新的RE,才是解决方法 04/17 13:23
这个我有了解过了
Gal4是接在原本BamHI跟SpeI的地方
没有影响到我要用的两个酵素的位置
※ 编辑: a14743535 来自: 140.112.79.176 (04/17 13:43)
84F：推 chaunen:ligation PCR 3个小时就可以知道结果, 1ul的ligation 04/17 13:42
85F：→ chaunen:product对PCR效率并没太大影响. 04/17 13:43
86F：→ chaunen:如此一来你可以知道到底有没有ligation成功 04/17 13:44
※ 编辑: a14743535 来自: 140.112.79.176 (04/17 13:46)
87F：→ chaunen:如果有,那就是後面transform的问题 04/17 13:44
88F：推 chaunen:ClaI这个酵素会受到dam dcm影响,DNA被甲基化就切不动. 04/17 14:09
89F：→ chaunen:也许位於4028bp的ClaI site是因为DNA被甲基化而切不动 04/17 14:10
90F：→ chaunen:根据原PO的讲法, XbaI or ClaI 单切/双切都是4.7kbp band 04/17 14:11
因为两个所切下来的片段才20~30bp而已~胶上看不太出来这微小的差异吧
※ 编辑: a14743535 来自: 140.112.79.176 (04/17 14:18)
91F：推 chaunen:ClaI(1036bp) 和XbaI切下来的小片段当然看不到. 04/17 14:24
92F：→ chaunen:重点是ClaI(4028bp)到底是不见了还是甲基化了,因为切不动 04/17 14:26
93F：→ chaunen:所以大家才会觉得vector本身可能就有问题 04/17 14:26
我不知道有什麽方法可以检查...
定序的话
也没有那个primer可以定到那个区域...
※ 编辑: a14743535 来自: 140.112.79.176 (04/17 14:35)
94F：推 a90648:其实定序用的primer自己设计一个就可以罗 04/17 14:45
95F：→ a90648:没软体可用就土法炼钢的数个20mer，Tm大约算一下就可以了 04/17 14:47
96F：推 chaunen:用NcoI切看看,应该会 700bp, 1.9k, 2.1k 04/17 14:53
97F：推 a90648:不然就是找个dam/dcm-的competent cell retransform 04/17 14:54
98F：→ a90648:vector，抽出来再切切看罗!! 04/17 14:55
99F：→ chaunen:原PO可以用vector NTI做一个自己的map 04/17 14:58
100F：→ chaunen:用addgene上的pBK-CMV 序列加上你们自己塞进去的Gal4 04/17 14:59
101F：→ chaunen:用甚麽酵素切会跑出多大size的band就会一目了然 04/17 15:00
102F：推 huuban:推楼上，没有primer就自己设计一个，一边在vector 04/18 13:25
103F：→ huuban:一边在你的基因上，今天订，明天你就可以PCR罗 :) 04/18 13:25
104F：→ huuban:话说，如果你最後成功了，记得把问题解决方式在整理上来:) 04/18 13:27
最近又试了几次
连ligase都换成新
现在变成连control(uncut vector)都长不出来...
之前明明就有长出来的说
※ 编辑: a14743535 来自: 27.245.228.127 (05/01 10:11)
105F：推 a90648:你可以把最近做的流程再打一篇问会比较好喔!! 05/02 14:21
106F：→ a90648:这篇已经被堆到後面了，比较难被发现 05/02 14:22