因为看到你说附近没人可以帮, 所以我指出一些可能的问题点... 但不确定真是你卡关的因素, 当然更希望你的问题已解决, 後面就不用看了 ※ 引述《jeffsu (欧巴马)》之铭言： : 这实验目前已经卡了一阵子 希望版友能帮忙看看有甚麽问题 : 目前我的实验是想看TIMP3 promoter 的转录活性 : 所以选定了一段-934~+278的位置 想接到pGL3-Basic vecter 上 : 利用软体分析之後设计不含此序列切位的primer : 5'端加上XhoI切位 primer 3'端加上HindIII切位 : 使用Pfx PCR 之後 跑胶确定为single band : 接着取1ug的PCR产物 与1ug的vector 同时切XhoI及HindIII 後OVER NIGHT ^^^^ ^^^^^^^ 你是用哪一牌的酵素? 用的buffer对两种酵素的相容性都是100%吗? 不需要切overnight, 反而会有乱切的风险 作用2-4 hr已非常足够 : 隔天跑胶後将之切胶纯化(也有使用直接纯化的方法) : 以vecter:insert 1:3 1:10等比例　ligation 16度　overnight後 : 隔天进行transformation，也顺便涂一盘单纯用BASIC的 : 结果只有BASIC有长，而切胶纯化後的都没有长 : 直接纯化不切胶的有长很多，但PCR确认过都是空载体（可能酵素作用不完全BASIC长的） ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 这部分代表 1. 有载体可能一刀都没被切 2. 有载体只被切了一刀, 然後ligation时重新黏回 所以才会长出带有空载体的菌落 (如果照预期被切两刀, 应该就都不会长) 因此代表你酵素作用不完全, 解决方式是DNA浓度降低一点, 以及在酵素反应结束後 必须跑胶然後切胶回收 跑胶时要放uncutted vector作为control 环状的载体跟被切成直线型的载体比较, 跑胶效率会不一样 而且环状质体跑胶时会有一条以上的bands 因此你回收直线的载体时, 理应看见其位置与环状载体不同, 并且只有一条band 电泳时间不要太久, 15分钟左右, 让band跑在胶片上方1/3-1/4, 看得出差异就该回收了 另外, 你提到当你切胶回收後甚麽都不长 这代表即使你切载体的酵素反应不完全, 跑胶回收时有环状或只被切一刀的载体时 却连带有空载体的菌落也生长不出来 表示你後面每个步骤都可能有问题...... 即使你解决了一个问题A, 但你还是会做不出来, 因为通常新手的问题都不会只有一个 然後你连问题A是否获得解决都无法知道 orz 所以我才建议你去找附近做得很顺的人帮忙 如果自己实验室内没有, 靠一下学长姐或老师去找其他实验室的专家帮忙 不然真的很难解决... 只能祝你好运 >"< 如果真的要靠自己土法炼钢做, 你最好就一步步来确认每个步骤OK 首先PCR产物先接到TA vector或其他质体上 (你可以用Blendtaq等, 具有部分proofreading及接A-tail的PCR酵素) 如此一来你在切割insert时的效率便可增加 至少你也可以确定在ligation时, 所有的insert两侧都是XhoI-HindIII tail 以类似的方式一步步解决...... 不过即使没人帮也不用太灰心, 作cloning的优点是你只需要一个对的菌落 所以当你重复改条件, 重复去作, 只要设计不是错的, 总是会有成功一日 ^^" 加油~ : 不知道板上有没有好心人能帮忙看看到底那边出了问题 : 感激不尽！～～ --

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