作者peqk (西瓜)
看板Biotech
标题[求救] IF染membrane protein的问题
时间Wed Apr 10 16:24:20 2013
大家好
我在细胞上overexpress一个膜蛋白
抽过membrane fraction压WB，确定他在膜上的确有高度表现
但是在染IF时遇到一个问题
我用的抗体认protein C端，但是protein是N端在膜外头
以下是IF protocol
1. PBS wash
2. 4% PFA fix 15min at RT
3. PBS wash
4. 1% BSA blocking 1h at RT
5. primary antibody 3h at RT
6. PBS wash
7. secondary antibody 2h at RT
8. PBS wash
9. DAPI RT 10min
10. PBS wash
11. mounting
本来都没有treat saponin，结果都看不到讯号
所以试了在step3,4之间treat 0.1% saponin，打1, 5, 10min三种condition
结果pattern是cytosol跟膜分不出来，无法看到标准的membrane pattern
找过其他家抗体，都没有人在卖认N端的抗体
请问各位有什麽好建议?
谢谢
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◆ From: 120.126.82.7
1F：推 abcam:好奇的是这和PVDF的材质是否有差?因为我之前要买PVDF膜的时 04/10 19:22
2F：→ abcam:看到目录上有专门给N terminal protein sequencing 04/10 19:23
3F：→ abcam:会不会也有关系?! 04/10 19:24
4F：→ puec2:那就是你的protein乱跑啦 你膜上有不表示其他地方没有吧? 04/12 16:16