作者pent (爱、失败、死亡)
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标题[求救] 抽RNA和Q-PCR相关问题
时间Mon Apr 1 17:48:27 2013
有些问题想请教，抽RNA的最後一步是用75% DEPC-H2O 配的75%酒精
之後，倒扣让它乾，这时候大家会放多久呢?
实验室的学姐说，她不敢让它放超过20分钟，不然太乾会很难溶，
但是我的状况是
，最後eppendorf里都会剩一滴水珠的部分，
这水珠到底是酒精??还是只剩下水???
因为这次，我十多个sample，细胞数约5*10^6抽RNA，
结果就一管，我看它里面有水珠，特地拿10ul pipet吸，
结果它的浓度最低，只有50ng/ul，其他至少都200ng/ul，
有人有遇过吗?
另外q-pcr，一定要差1.5倍 or 2~3倍以上才是真的有差异吗?
我是primary culture的细胞，要比较有hypoxia跟没有，target gene表现有没有变化
还有我用Sybr green跑的时候，GAPDH,target gene, NTC 共40 cycles,
no-template control(NTC)都没signal，
但是用TaqMan，大概在36-37cycles NTC都会友signal，这是正常吗?
谢谢回答
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.72
1F：推 leoblack:你学姐说的没错~真的不要放太乾~会很难溶 04/01 23:19
2F：推 qqaz:我自己抽RNA是放在laminar flow抽风到乾(RNA pellet白色变无 04/02 14:49
3F：→ qqaz:色，转cDNA再跑real-timePCR 大约5~10cycle便有讯号 04/02 14:50
4F：→ qqaz:若是你细胞太少，细胞size较大，那麽你就要一次收大量的细胞 04/02 14:52
5F：→ qqaz:Sybr green，GAPDH跑到40 cycles含量已经太稀少 04/02 14:53
6F：→ qqaz:real-time PCR 每差1个cycle都是2^1.7，你若做二重复，同样品 04/02 14:58
7F：→ qqaz:都有可能因为些微的误差而有差异1~2cycle，故你的实验组差异 04/02 14:59
8F：→ qqaz:不可以过小，不然无法知道是误差还是差异 04/02 15:00
sorry, 我有些地方打错，是我总共跑40cycles，不是GAPDH跑到40才有训号
但如果我做三次，不是指三重复，是整个实验，养细胞，hypoxia...，repeat三次，
然後三次Q-PCR 分析Ct值後，差异倍数变化从1.1-2.2 或从1.4-1.7倍的差异
这样要算是有变化还是没变化???
会有人argue说，这才1.x多倍的增加，一定不是真的 吗??
※ 编辑: pent 来自: 140.109.40.72 (04/03 23:01)
9F：推 qiet:有没有差不是用感觉吧, 看统计是否有显着差异啊 04/03 23:42
10F：→ qiet:另外也要搭配上蛋白质的表现才足够证明有差 04/03 23:43
11F：推 chaunen:放乾一点没差, 加DEPC水後 58度C加热15 mins即可 04/05 02:20
12F：推 mesenchymal:放乾前先用suction或离心把大部分液体移除 04/06 09:29
13F：→ mesenchymal:三重复後统计算看看就知道有没有显着差异了 04/06 09:30
14F：推 ararthur:放乾点没差 RNA少量不会不好溶 不过倒扣...乾不大了吧 04/07 21:11
15F：→ ararthur:我习惯用75%wash完再用100%wash 倒乾 spin 吸乾 37度或 04/07 21:13
16F：→ ararthur:laminar flow五分钟 就会全乾了 量少可能是透明或半透明 04/07 21:14
17F：→ ararthur:量真的很多 则会呈现白色块状 04/07 21:14
18F：→ ararthur:数据部分 统计有差就有差 统计没显着就没差 千万别主观 04/07 21:15