作者a14743535 (pig)
看板Biotech
标题[求救] gel extraction
时间Tue Mar 19 19:55:28 2013
各位大哥大姊好阿
我最近在做clone的实验
已经将insert(900bp)成功接进yT&A当中
现在要大量培养
用两个限制酶将insert切下再接入另外一个vector中
我取约1ug的plasmid进行RE digest(总反应体积20uL)
37度，2hr；70度水浴，10min，中止反应
全部load进 1% agarose gel跑DNA电泳
用bioman的kit进行gel extraction
用20ul EB进行回溶
问题来了我纯化出来的浓度都很低(不超过5ng/uL)
甚至没有...而且A260/280也不对
kit应该是没问题
因为我用了别人借同样的kit还有别牌的kit结果都一样
喔对~我在离完酒精後会再放入60度的烘箱5~10min(不知道有没有影响)
有没有人知道怎麽会这样@@
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 124.11.135.87
1F：推 hangzer:我不知道你的kit有没有写 不过我用的kit上有说不要用加热 03/19 20:05
2F：→ hangzer:法去酒精 但是我不知道为什麽就是了XD 03/19 20:06
3F：→ a14743535:我是因为抽mini的时候可以放烘箱 03/19 20:23
4F：→ a14743535:然後我想说最後面的步骤都一样~那应该也可以放烘箱 03/19 20:24
5F：→ a14743535:就把他放进去了 03/19 20:24
6F：→ a14743535:可以请问h大是用那一家的吗？ 03/19 20:33
7F：推 kevin1983:烘箱应该是没差 03/19 21:13
8F：→ kevin1983:不过DNA binding和elute有等个几分钟再离心吗? 03/19 21:15
9F：→ blence:先别问有多少,其实我很想问你认为纯化出来的浓度应该多少？ 03/19 21:16
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.135.87 (03/19 21:17)
10F：→ blence:显然这件事kit很无辜,是你没有仔细想过浓度应该会多少 03/19 21:18
11F：→ a14743535:应该至少要有个10吧@@ 03/19 21:18
12F：→ blence:好的像Q牌gel elution效率大概80%,若你只用20ul,怎麽有10？ 03/19 21:21
13F：→ a14743535:回k大~我有等个几分钟才离心 03/19 21:21
14F：→ a14743535:呃...我用比例去估算的 03/19 21:24
15F：→ a14743535:load进去的总共是1ug DNA~recovery大概是60%的话 03/19 21:25
16F：→ a14743535:用50uL回溶应该可得到600ng的DNA~ 03/19 21:26
17F：→ a14743535:那20uL应该有个240ng左右吧@@ 03/19 21:26
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.135.87 (03/19 21:26)
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.135.87 (03/19 21:27)
18F：→ a14743535:换算成浓度就10左右~@@ 03/19 21:27
补充一下~我有把两个well的放在一起回溶过
※ 编辑: a14743535 来自: 124.11.135.87 (03/19 21:36)
19F：→ blence:晕倒.....你是切1ug plasmid,非1ug的900bp吧 03/19 22:11
20F：→ a14743535:对 03/19 23:16
21F：→ a14743535:1ug的plasmid切出来的insert不是也应该是1ug吗?? 03/19 23:18
22F：→ a90648:照你的算法光insert就有1ug，那就加上vector 2ug 03/19 23:24
23F：→ a90648:这很有问题阿!! XD 03/19 23:24
24F：→ a90648:请辜狗将bp换算成ug 03/19 23:26
25F：→ xxtomnyxx:1ug plasmid 切下来的怎麽会有 1ug? 03/19 23:28
26F：推 a90648:要粗略换算的V:I下去分1ug就可以了 03/19 23:29
27F：→ xxtomnyxx:假设vector包含900的insert有4K，1ug plasmid 拿去切， 03/19 23:29
28F：→ a14743535:哈哈哈~~我忽然发现我的这个数学有点白痴~~XD 03/19 23:30
29F：→ xxtomnyxx:900 bp 的片段只有会 1ug×(900/4000)= 225 ng 而已啊。 03/19 23:30
30F：推 joseph103331:所以你有没有做接下来的实验啊? 03/19 23:35
31F：→ joseph103331:这种浓度常常都很低 因为用kit抽 我就直接ligation了 03/19 23:36
32F：→ joseph103331:如果vector也有切过胶的话 有长有中 03/19 23:37
33F：→ a14743535:没有耶~因为A260/280的值也很有问题 03/19 23:39
34F：→ a14743535:所以我就没用@@ 03/19 23:39
35F：→ xxtomnyxx:通常 GelEx 的 260/280 本来就会很难看，毕竟浓度很低。 03/19 23:41
36F：→ xxtomnyxx:一般来说用跑胶确认比较好，只要有 band 我都会不管 03/19 23:41
37F：→ xxtomnyxx:260/280 直接继续往下做。 03/19 23:41
38F：推 joseph103331:推跑胶确认 不过我通常会切个5ug以提高机率XD 03/19 23:43
39F：→ joseph103331:反正用的enzyme浓度还是一样嘛.... 03/19 23:44
40F：→ blence:不需跑胶确认,也不需提高浓度,更不须测浓度,算数推估即可 03/19 23:58
41F：→ blence:前面三种除了让你更费工更忧虑失败以外,没有实质帮助 03/20 00:00
42F：推 conective:应该是要提高一开始切的量吧 03/20 08:23
43F：推 iceking:1. gel extraction的胶,越小越好~ 以提高浓度 03/20 09:30
44F：→ iceking:2 建议一定要跑胶确认~ 比A260/280 有参考价值~ 03/20 09:30
45F：推 iceking: 3. 依经验这浓度继续跑下去也是能成功~ 03/20 09:35
46F：→ a14743535:感谢大家的指点~我会下更多量的plasmid去切的 03/20 13:40
47F：→ blence:惨,ligation不需要太多insert,现有的浓度跟总量已经够用了 03/20 13:51
48F：→ blence:增加plasmid用量只是为跑胶看到,也不会因此用在ligation上 03/20 13:53
49F：→ blence:结果还得付出切多量导致切不乾净,效率不佳,纯化不便等问题 03/20 13:55
50F：→ blence:至於gel elute後跑胶的问题更不用说,几篇板上文章反应elute 03/20 13:58
51F：→ blence:之後跑胶看到size变高或变低导致实验不敢进行,更是跑胶缺点 03/20 13:59
53F：推 joseph103331:都要切胶纯化了 本来的plasmid切不乾净其实无妨吧 03/21 14:59
54F：→ joseph103331:实际上的确也是不用切这麽多 但能提升ligation的机会 03/21 15:00
55F：→ joseph103331:像这种搬家的实验切完胶以後通常可以直接往下做 03/21 15:00
56F：推 huuban:其实浓度低的状况你可以取2ul跑胶看东西在不在.. 03/22 00:15
57F：→ huuban:如果东西在，跟ladder比亮度算浓度，还是可以接进vector的 03/22 00:15
58F：→ iceking:对阿! 与其取2ul来测260/280,不如拿来跑胶.跑胶也可知浓度 03/22 09:37
59F：→ blence:跑胶,以原po的例子2ul怎麽看得到,一直强调跑胶前请想一下 03/22 12:25
60F：→ blence:一般用的EtBr灵敏度极限,再想想2ul看不看得到,若是3~500bp 03/22 12:27
61F：→ blence:同样切1ug,连5~10ul也可能看不到,结果就是elute全拿来跑胶 03/22 12:29
62F：→ blence:前一个说跟ladder比亮度的就更扯了,ladder大概都25~50ng 03/22 12:33
63F：→ blence:如果原po也这样比较,大概可ligate的,会以为elute失败而丢掉 03/22 12:37
64F：推 iceking:婀~ 跑胶的灵敏度是ng 原po的例子已经足以看到~ 03/22 12:59
65F：→ blence:EtBr大概5~10ng,内染又更惨,或是你觉得原po是用高级染剂 03/22 13:04
66F：推 iceking:5~10ng 所以原po的2ul足以看到~ 没错阿! 03/22 13:16
67F：→ blence:原po的浓度都低於5,取2ul是要挑战机器的灵敏度 03/22 13:26
68F：→ blence:而且今天做的是300~500或200bp的miRNA,那2ul跑胶不就更惨 03/22 13:28
69F：→ blence:跑胶可以确认,但不少人都把可往下做的东西,胶没看到就丢了 03/22 13:32
70F：→ blence:这类文板上也不少,都是小片段跑胶看不到就归罪kit纯化失败 03/22 13:34
71F：推 iceking:事实上依经验,EtBr可以看到更少的量,2~3ng都还可以~ 03/22 13:54
72F：→ iceking:做ligation,你势必要知道insert的量,方法不外乎就是 03/22 13:55
73F：→ iceking:1.测OD 2.跑胶 这两种方法所需的体积几乎是一样的 03/22 13:55
74F：→ iceking:大约都是1~2ul就可以~ 因此没有所谓全拿来跑胶的问题~ 03/22 13:56
75F：→ iceking:而跑胶可以获得的资讯,比纯测OD要多~ 03/22 13:58
76F：→ huuban:其实测nanodrop浓度不到10，也可能一跑胶就看得到band喔 03/22 13:58
77F：→ huuban:简单的说取2ul跑胶看不到那你应该很难接上，就这麽回事 03/22 13:58
78F：→ iceking:你可以知道size,可以知道大概的量~ ligation只要知道大约 03/22 13:58
79F：→ iceking:即可~ 我的经验也跟hunban大一样~ 03/22 13:59
80F：→ blence:以我最近做的200+3k, 切1ug,照原po的条件,浓度只有1.5ng/ul 03/22 14:02
81F：→ blence:但就算是200+7k的pLKO,浓度连1ng都不到,ligation也很好做 03/22 14:04
82F：→ blence:小片段浓度很低本来就很正常,没有浓度低就接不起来这回事 03/22 14:05
83F：→ blence:像ligation时200bp拿1ng,2kb就要20ng,就molar比ng更重要 03/22 14:09
84F：→ blence:以跑胶或测OD眼睛想看到ng来评估ligation成功是很不恰当的 03/22 14:12
85F：→ blence:因为小片段看不到不代表失败,反之大片段看得到却代表会失败 03/22 14:14
86F：→ blence:iceking讲出重点了,知道size计算最重要,测OD跟跑胶都可省略 03/22 14:17
87F：推 tsubasawolfy:跑胶只是求心安 O/N时比较睡的着XDD 03/22 14:17
88F：→ tsubasawolfy:浓度大小自己算一算就知道跑胶到底看不看的到 03/22 14:18
89F：→ tsubasawolfy:测OD部分反而比较要注重dna品质(260/280 260/230) 03/22 14:19
90F：→ iceking:可省略一样做得出是没错,但这是偷吃步,实验还是要拿得出 03/22 15:25
91F：→ iceking:证据~ 我讲的是比较规矩的做法罢了. 260/280在此时其实 03/22 15:26
92F：→ iceking:比较不具参考价值了,因为错误率太大~ 03/22 15:27
93F：→ iceking:我知道後面成功,就代表过程没问题了,只是过程的确认在科学 03/22 15:29
94F：→ iceking:里面也是很重要的~ 03/22 15:29
95F：推 tsubasawolfy:看後面ligation是哪一种吧?sticky跟TA哪种就不要求 03/22 15:31
96F：→ tsubasawolfy:blunt end就龟毛了.... 03/22 15:32
97F：推 joseph103331:知道哪里可以省略也是一种know-how阿~ 03/23 19:28
98F：推 joseph103331:要用到跑胶等等方式都是用来trouble shooting的 03/23 19:30
99F：→ chaunen:如果没有, 你後面transform到天荒地老也不会有clone的. 04/17 13:44