※ 引述《ennnnno (伊诺)》之铭言： : 最近做plaque assay遇到很大的问题 : 每次加完病毒液後细胞都会飘浮=__= : 有的well会有的不会,我好难控制他!为什麽为什麽呢??? : protocol如下: : 1. seeding RD cell 4*105/ml到 6 well plate, 於5% CO2,37℃下培养24hr 感觉起来有点少 最後体积是多少? RD cell很大吗? : 2. 将病毒液稀释至10-1~10-8。 你用什麽medium稀释? : 3. 移除6well中的上清液後,加入稀释好的病毒液,一个well加400μl 我是用12 well BHK CELL 也是有移除上清液 但是 其实你可以试试不要移除上清液 然後让他感染overnight 我们家也是有人这样做 : 4. 加入病毒液後,每15min 用手摇晃一次,使病毒液均匀分布,1hr 我觉得没有必要 你要给病毒有时间沉降 这样一直摇感染 能力就算不会降低 也不会比较高 有人甚至会用离心的方式 增加病毒的感染能力 如果你说要均匀分布比较好算plaque... 阿你都已经做到连续稀释了 如果一格有几十颗plaque分不开 应该做的是增加稀释的倍数 而不是让病毒"均匀分布"吧? : 5. 加入2ml含methyl cellulose的DMEM medium : 6. 37℃培养3~4 day 长蛮快的嘛 : 7. 观察有plaque形成後,去除上清液,加10% formaldehyde (2ml/well) : 8. 室温放30min,去除上清液 : 9. 加1% crystal violet,室温放30min : 10.ddH2O wash,air dry,计数 : Methyl cellulose DMEM: : 2x DMEM中含4%的P/S和4%FBS,再和1%的Methyl cellulose以1:1混合 : 想要请问的问题有: : 1.病毒要dilute至medium中时,medium需要先warm好吗? 其实是不用 低温只是让病毒进入细胞的动作暂停 但是一回温病毒就会钻进去了 有的人会用这个 原理作同步化的实验 : 2.我都是很小心的将病毒液从well的边边加进去的,一开始加进去没事,等一会再看, : 就会有细胞飘起来,然後实验就失败了,我是不是哪里没做好呢?而且细胞飘起来 : 的地方并不是我加入病毒液的地方,所以应该也不是我冲的太大力而导致飘起 有可能是你用来稀释的medium有问题 : 3.要加入含methyl cellulose的DMEM时,病毒液要吸起来吗? 没在吸 不过我是 12well 180ul virus + 2ml methyl cellulose : 4.plaque的形成点要怎麽抓??是看到有一点plaque形成就ok吗? : 谢谢` 拿起来透光看 会看到一坨一坨的细胞叠起来 那就是plaque 固定以後一冲就掉了 --

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