作者ennnnno (伊诺)
看板Biotech
标题[求救] plaque assay
时间Tue Jan 8 16:48:55 2013
最近做plaque assay遇到很大的问题
每次加完病毒液後细胞都会飘浮=__=
有的well会有的不会,我好难控制他!为什麽为什麽呢???
protocol如下:
1. seeding RD cell 4*105/ml到 6 well plate, 於5% CO2,37℃下培养24hr
2. 将病毒液稀释至10-1~10-8。
3. 移除6well中的上清液後,加入稀释好的病毒液,一个well加400μl
4. 加入病毒液後,每15min 用手摇晃一次,使病毒液均匀分布,1hr
5. 加入2ml含methyl cellulose的DMEM medium
6. 37℃培养3~4 day
7. 观察有plaque形成後,去除上清液,加10% formaldehyde (2ml/well)
8. 室温放30min,去除上清液
9. 加1% crystal violet,室温放30min
10.ddH2O wash,air dry,计数
Methyl cellulose DMEM:
2x DMEM中含4%的P/S和4%FBS,再和1%的Methyl cellulose以1:1混合
想要请问的问题有:
1.病毒要dilute至medium中时,medium需要先warm好吗?
2.我都是很小心的将病毒液从well的边边加进去的,一开始加进去没事,等一会再看,
就会有细胞飘起来,然後实验就失败了,我是不是哪里没做好呢?而且细胞飘起来
的地方并不是我加入病毒液的地方,所以应该也不是我冲的太大力而导致飘起
3.要加入含methyl cellulose的DMEM时,病毒液要吸起来吗?
4.plaque的形成点要怎麽抓??是看到有一点plaque形成就ok吗?
谢谢`
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.249
1F：推 leoblack:要把没attach成功的病毒洗掉才加cellulose不是嘛? 01/08 17:04
2F：推 jabari:细胞青春吗?继代方式?可惜RD我不熟@w@ 可以改用低温agarose 01/08 17:56
细胞是21代的,继代方式是指?就是用trypsin处理後会加medium,然後离心
取一点细胞maintain,细胞我是拿别人家做plaque assay ok的细胞
可是都找不出原因,为什麽别人家都做的起来但我做不好@@
也去别人的实验室看过操作,其实都差不多啊
所以才想说上版询问有没有奇怪的解决之道还是有更多需要注意的
4F：推 paua:3. 要，要不然你的cellulose就被不均匀的稀释了 01/08 23:16
5F：→ paua:4. 依细胞和病毒而定，你可参考相关论文，若没得参考。 01/08 23:16
6F：→ paua:那就大约过24, 36, 72小时去观察，待明显的plaque形成， 01/08 23:17
7F：→ paua:但又不能大到变成两三个plaques黏在一起 01/08 23:18
8F：→ paua:要不然会很难计数喔~ 01/08 23:18
9F：→ paua:1. 我用4度培养液; 2. 因为跟你使用的RD细胞不熟，所以不晓得 01/08 23:20
※ 编辑: ennnnno 来自: 111.255.177.203 (01/09 00:32)