作者devilcos (努力赚钱)
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标题[求救] 有人用过中研院的shRNA吗?
时间Tue Oct 9 15:11:26 2012
之前有爬过文 大家拿到中研院的shRNA後好像都是直接做
有人是拿到之後将shRNA切下来接到其他的vector吗?
由於实验需要 我订了中研院的shRNA 以後用vector上的NdeI与EcoRI将shRNA切下
size约130bp 但是切下来後看不到130的地方有band shRNA的量我用1ug去切
切了好几次 顶多只看到200bp的地方有band但是会糊糊的
gel extraction後的浓度只有6ng/ul 有试着ligation与transform 但涂plate後没长东西
shRNA的序列有先去定序了 确定序列上是有NdeI与EcoRI两个切位
然後我要接进去的vector大概是8kb
已经切好多次啦但还是不行>"< 不知道有没有人这样做过成功的拜托告诉我
另外酵素是用NEB的 都是新的 所以应该没有放太久坏掉的问题
麻烦大家了Orz
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◆ From: 140.116.61.106
1F：推 silentence:insert size这麽小会很不好接 而且照gel时讯号会很弱 10/09 15:41
2F：→ silentence:从描述看来应该是insert量不够的问题 10/09 15:42
3F：→ blence:pLKO至少7kbp,切1ug顶多拿到60ng,elute更不可能拿到6ng/ul 10/09 16:27
4F：→ blence:除非你用8ul或更少去elute,而且也浓度跑胶也不可能看到东西 10/09 16:30
5F：→ blence:如果长度只有130bp,拿plasmid去PCR後直接切与接或许较方便 10/09 16:33
6F：推 Ianthegood:楼上专业 10/09 17:05
7F：→ devilcos:好谢谢各位的意见 我会试着用PCR放大的方式去做做看 10/09 17:30